CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入

1、CRISPR-Cas9 大全：基因敲除、点突变、基因插入2015-10-15contortsCRISPR-Cas系统简介CRI SPR-Cas系统的应用技术OR I SPR-Cas系统的应用前景1. CRISPR-Cas系统简介1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史 1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年, 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005年发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生

2、物的 RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2007年，Barrangou等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入 侵；2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能 2013年初，MIT的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对A293T细胞EMX1 PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞 基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/ Cas9在A293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定 点插入。1.2CRISPR-Cas系统的结构

3、CRISPR-CAS系统旳组成主要包括：由不连续的重复序列R ( repeat)乌长度相似的同区序列$( spacers)间隔排 列而成的CRISPR簇，前导序列1_( leader)以及一系列 CRISPR相关蛋白基因cas。8$基因前导序列重复序列间隔序列protospacerCas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。1. 3 CRISPR-CAS系统的作用机理口 CRISPR的高度可变的间隔区的获得原间隔序列入侵核酸丿泉间隔序列肿M5- aCGMCCg(aGAGGGAACGCLOGG

4、/GACTChGG|in 3*31- GTGCTCKKXiCTCCTCTCCC TTCiCGTCCCTCTGAC TCC AC- 5*间隔序列正向垂复序列新的问隔序列整合到CRISPR基因座Cas蛋白复合物Fig. 2 New spcacer of CRISPR acqusition图2 CRISPR获得新间隔序列示意图首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM （NGG序列）,将临 近PAM的序列作为候选protospacer;然后在CRISPR基因座的5端 合成董复序列；最后新甬间隔序歹1整合到两个重复序列之向1. 3 CRISPR-CAS系统的作用机理 CRIPSR基因座的表达 （包

5、括转录和转录后的成熟 力口工）当该噬菌体再次入侵细 菌时，CRISPR簇首先转录 为长的crRNA前体，然后逐 步被加工成小的成熟的 crRNAoCRISPR/Cas系统活性的 发挥或者是对外源遗传物 质的干扰tracr(as9jl： I 讨Pre-crRNACas9 CiisI(ais2Csh2 引导序列 CRISPRlllllllllllllllllllllllll； XllllllllllllllilllllllllllllllltllllllllllllllltlRNase III入侵的病毒或质粒DNAcrRNA结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互

6、补配对精确地与目标DNA相 结合，随后Cas蛋白对目 标DNA进行断裂和降解。1. 3 CRISPR-CAS系统的作用机理CA5Creation of a novel spacerTargeting of viraJ DNADouble stranded viral DNAl nactivation ol viral DNACASCAS crRNA complexCell membraneTranscriptionCRSPR心 $9Gen© DisruptionGone CorrectionDNA Insertion 4图1.用基因重组技术可以做M种基豳定点轴。心2、CRISPR-C

7、as系统的应用2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑 技术基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传操 作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA, 切断的DN A右被细胞内的DN A修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 蒔异究变的弓入*口定点孑专基医口基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点199620112013ZFNTALENCRISPR/Cas2.1

8、 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。Mali等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR相关蛋白 Cas9,在一段人为重组的sgRNA( smal I-guide RNA)的引导下，针对 小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编 程RNA进行DNA改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。UUUCas95I ! I . I ! I I , (, I ! ( r ! !AAGGCUAGUCCGUUAUCAAnN2NCCinm23bp genomic target sequencegui

9、de RNA例子：基因敲除的实验过程k在把基因序列中寻 找NGG序列获得其附近 20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合, 设计出sgRNA并合成该 序列。2、将该序列以及cas9 基因连入如图所示载 体。3、转化感受态，质粒 小提，测序验证。4、细胞培养与细胞转 染5、敲除效果检测。6、建立稳定敲除的细 胞株CMM动子NL魁沁啊A呢动子舲RNA或鯛RNAnHU on ro on uo onuo OH upft细RRRRRRRRRRRflPPpppqpqoooqopopQflORQQppopflpqqoop8bbdbdoood6dd66bt)b668b888bb6ddbq嵌合RU或向#

10、RNA2. 2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活口在CRISPR/Cas9的II型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白 失去对DNA的切割活性，但不影响其与DN A结合的能力。这种失 去DN A切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Cas9o将d Cas9与 gRNA在细胞中共表达，贝也RNA可以介导dCas9蛋白与DN A结合。 如果dCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用； 如果dCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始” s cRNAInhihiiion of iranscripiioii elongationInliihii

11、H)nof huicription initiation2. 2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活CRISPR/Cas9系统用于转录抑制需要PAM (3bp)和至少12bp的gRNA- D N A配对SSjlS阳必豐響恵邂青确识别靶基因的特点，将d Cas蛋白与 富臨豎霧虫白质功月匕域融合则可构建具有转录激活活性的口常黑釁需激活因子可通过将dCas9与单纯疱疹病毒转录激活子3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景3. 1CRISPR-Cas9技术的优势而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核昔酸就行。只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不 具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp,因此比构TALENs和ZFNs更简单 方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方 面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将3种主要生 物聚合物（DNA、R N A和蛋白质）结合在一起的特殊 能力。口各种功能性蛋白都可以通过与Cas9