(种子学课件）种子超低温贮藏

1、( (种子学课件种子超低种子学课件种子超低温贮藏温贮藏 一、种子超低温贮藏的概念和意义 1.种子超低温贮藏的概念 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196)为冷源，将种子等生物材料置于超低温下(一般为-196)，使其新陈代谢活动处于根本停止状态，而到达长期保持种子寿命的贮藏方法。 在-196低温下，原生质、细胞、组织、器官或种子代谢过程根本停止并处于“生机暂停的状态，大大减少或停止了与代谢有关的劣变，从而为“无限期保存创造了条件。 2.种子超低温贮藏的应用和意义 这种保存方式不需要机械空调设备及其他管理，冷源是液氮，容器是液氮罐，设备简单，保存费用只相当于种质库保存的14。液氮保存的种子不需要特

2、别枯燥，一般收获后，常规枯燥即可，也能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。适合于长期保存珍贵稀有种质。 二、不同种类种子对液氮低温反响的差异 根据种子对液氮低温的反响，将种子分为三种类型(Stanwood，1985)：忍耐枯燥又忍耐液氮的种子(desiccation-tolerant LN2-tolerant seed)；忍耐枯燥对液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2-sensitive seed)对枯燥和液氮均敏感的种子(desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。 1.忍耐枯燥和液氮

3、的种子 多数农作物，园艺作物种子都能忍耐枯燥和液氮低温。目前，已有许多研究者成功地将这类种子冷却到液氮温度，再上升到室温，不损害种子生活力。但是外在因素如冷冻解冻速度，种子含水量等能影响种子对液氮的反响。 种子含水量过高在冷冻和解冻过程中死亡，含水量过低又会导致种子生活力的局部丧失。不同的植物种种子都有一个适宜的含水量范围。 表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率石思信等，1985 适合于冷冻保存的最高含水量(high moisture freezing limits，HMFL)就是种子含水量的临界值。在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异(表2)。 种

4、子含水量超过HMFL，冷冻到一定温度，种子死亡。例如，小麦种子含水量高于268，冷冻到-7那么发芽率下降到25(表2)。根据试验，小麦种子含水量为5.716.4，在液氮温度(-196)冷冻保存24个月之后发芽率仍在92%96%，同对照相比没有明显差异。表2 几种作物种子冷冻时含水量的临界值 较多的研究报道认为，冷冻和解冻速率对多数植物种子冷冻到液氮温度影响不大。然而莴苣和芝麻种子却不一样。Roos(1981)用莴苣种子做试验，其含水量接近于HMFL值即19，发现用200min的速率冷冻几乎百分之百的成活，假设用222min或更低的速度冷冻，生活力明显下降。水分非常低的芝麻种子以130min缓慢

5、冷却时，几乎100存活而不受水分的影响。但以200min冷冻时，种子生活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生活力的影响同种子含水量有关，假设种子含水量在适宜范围内，那么慢速或快速冷冻对多数种子的成活率没有明显影响。在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变化，种子要经受极大的物理压力。如果种子的细胞间质承受不了这种压力，就会产生物理损伤。当种子在上升到室温之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程中。当种子只暴露在液氮气相中约-150 ，种子没有损伤，小局部损伤发生在-150 -196 之间。 2.忍耐枯燥对液氮敏感的种子 许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属和咖啡属

6、的植物种子属于这种类型。这类种子多数能枯燥到含水量10以下，但是不能忍耐-40以下的低温。例如榛子含水量可降到6，冷冻到0-20不失去生活力。但是当温度降低到-40以下种子生活力受损。忍耐枯燥对液氮敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)，有的种含量高达6070。含油量是否是引起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作物种，目前还只能无性保存。如果建立了超低温冷冻保存技术，可改进这类植物种质长期保存的方法从而改进育种和繁殖技术。 3.对枯燥和液氮均敏感的种子 这类种子就是顽拗型种子，它们的寿命很短，难以保存。

7、三、种子超低温贮藏的技术关键 1.寻找适合液氮保存的种子含水量 只有在适宜的含水量范围内，种子才能在液氮内存活。 2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解冻特性有差异，需分别探讨，以掌握适宜的降温和升温速度。 3.包装材料的选择 根据报道，包装材料有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象，而影响种子的寿命。 4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜(DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但又不超过渗透能力和中毒的界限。渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，防止了细胞过分脱水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外到达平衡以起到充分的保护作用。) 5.解冻后的发芽方法 经液氮贮存后种子的发芽方法是一个容易被研究者无视的问题，液氮保存顽拗型种子难以成功，可能与保存后