EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定ppt课件

1、实验实验5454E.Coli E.Coli 感受态细胞的制备、感受态细胞的制备、质粒质粒DNADNA的转化、提取与酶的转化、提取与酶切鉴定切鉴定 刘如石刘如石一一. 实验目的和要求实验目的和要求 1、经过本实验了解和掌握氯化钙法、经过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术；转化受体菌细胞的原理与技术；2、了解质粒、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分别、提取质解法从大肠杆菌细胞中分别、提取质粒粒DNA的方法；的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶

2、电泳的操作方法；和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 经过本实验了解大肠杆菌感受态经过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、细胞制备、DNA转化、限制性内切酶转化、限制性内切酶在分子生物学研讨中的意义与作用。在分子生物学研讨中的意义与作用。二二.实验原理实验原理 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备:所谓感受态所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理形状，可以经过物的一种生理形状，可以经过物理与化学方法诱导构成，也可以自然理与化学方法诱导构成，也可以自然构成，在基因工程技术中通常采用诱构成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞普导的方法。用于转化

3、的受体菌细胞普通是限制通是限制-修饰系统修饰系统Restriction-Modification缺陷的变异株，以防缺陷的变异株，以防止对导入的外源止对导入的外源DNA的切割，用符的切割，用符号号R-M-表示。其根本原理是：细菌表示。其根本原理是：细菌处于处于0的的CaCl2低渗溶液中，会膨低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒转化混合物中的质粒DNA构成抗构成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物黏附于钙磷酸复合物黏附于细胞外表，经细胞外表，经 (4) (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别一样的序列，、有不同来源的限制性内切酶

4、可以识别一样的序列，甚至切割的位点也一样，称为同裂酶或异源同工酶，如甚至切割的位点也一样，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa IIHpa II与与Msp IMsp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNADNA切割后可产切割后可产生一样的粘性末端，称为同尾酶，如生一样的粘性末端，称为同尾酶，如BamH IBamH I与与Bgl IIBgl II。色，可确定色，可确定DNA在胶中的位置。在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的要素：迁移率的要素： DNA的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； DNA构象；构象； 电场强度；电场强度； 碱基组成与

5、温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。组成。 三实验资料与设备：三实验资料与设备：1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净任务台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培育箱、超净任务台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培育箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 管、管、tip头头 、烧杯、量筒、烧杯、量

6、筒溶液溶液III: III: 乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, (3M, pH=4.8)( 60mLpH=4.8)( 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋冰醋酸，酸，28.5mL H2O)28.5mL H2O)；RNase ARNase A： 10mg/ml10mg/ml；TETE缓冲液缓冲液: 10mmol/L: 10mmol/L，Tris-HCl, Tris-HCl, 1mmol/L1mmol/L，EDTAEDTA，pH8.0pH8.0；四操作步骤四操作步骤: ( (一一) ) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1 1、重新活化的、重

7、新活化的E.coli DH5E.coli DH5平板上挑取一单菌落，平板上挑取一单菌落，接种于接种于3 35ml LB5ml LB液体培育中，液体培育中，3737振荡培育至对数生长振荡培育至对数生长期期(12h(12h左右左右) )； 2 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:1001:501:50转接于转接于100ml LB100ml LB液体液体培育基中，培育基中，3737振荡扩展培育，当培育液开场出现混浊振荡扩展培育，当培育液开场出现混浊后，每隔后，每隔202030min30min测一次测一次OD600OD600，至，至OD600OD600为为0.30.30.50.5时时停顿培育，

8、并转装到停顿培育，并转装到1.5 mL1.5 mL离心管中；离心管中； 3 3、培育物于冰上放置、培育物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g离心离心10min10min，弃去上清液，参与，弃去上清液，参与1 1 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaCl2L CaCl2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞, , 冰浴冰浴2020分钟；分钟；CaCl2CaCl2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5 5、0 044， 4000g 40

9、00g离心离心10min10min，倒净上清培育液，再用，倒净上清培育液，再用1.0 1.0 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaCl2L CaCl2溶液悄然悬浮细胞，冰浴溶液悄然悬浮细胞，冰浴20min20min； 6 6、 0 044， 4000g 4000g离心离心10min10min，弃去上清液，参与，弃去上清液，参与100 L100 L冰冷冰冷的的0.1mo10.1mo1L CaCl2L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；成了感受态细胞悬液； 8 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，

10、假设在、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，假设在44放置放置121224h24h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高4 46 6倍；也可参与占总体积倍；也可参与占总体积1515左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml1.5ml离心管中，置于离心管中，置于- -7070条件下，可保管半年至一年。条件下，可保管半年至一年。二质粒二质粒DNADNA的转化：的转化： 1 1、每、每100100L L感受态细胞悬液中参与感受态细胞悬液中参与1 1L L质粒质粒DNA,DNA,悄然悄然摇匀，同时设置三组对照：摇匀，同时设置三组对照：(1)(1)不加质粒，不

11、加质粒，(2)(2)不加受体不加受体菌，菌， (3) (3)加知具有转化活性的质粒加知具有转化活性的质粒DNADNA，详细操作按下，详细操作按下表进展：表进展：* *阳性对照，用知具有转化活性的阳性对照，用知具有转化活性的pGEX-PDIP-rpGEX-PDIP-r质粒质粒DNADNA进展转化进展转化 液，再用液，再用7070的乙醇洗涤一次，的乙醇洗涤一次， 12000g 12000g离离心心1min1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上枯燥质粒；后在中空浓缩系统上枯燥质粒； 9 9、参与、参与4040L L含含20 20 g/mL g/mL RNase ARNase A的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或TE TE 缓冲液溶解提缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解取物，室温放置直到质粒完全溶解( (约约8min)8min)，存于，存于2020或直接用于酶切。或直接用于酶切。五五. 实验结果报告：实验结果报告： 1、转化效率的计算、转化效率的计算 ： 转化子总数菌落数转化子总数菌落数转化