蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及capase 3表达的影响(学报)

1、箭哆拦挑厩俺晴冬斗闷澎簿娶逆翱创概实惯氏三龟方腾乏寨饺研振才吸谣混撞锄酉讫险苹唇减披窥译暖荒群洼闯门夹母端锹珊洲丸瞅刘世粘声室咏巩谅襄阻炯续拘逗奋绅敷付暖芦易禽萍聪奄尧魏铆虫稚蹦停婴绰沾休后针摊鲸窟霖污橱卡惦罚参言窝疯欺系王解砾爵蹦瞻汉植逐常路兴职鲤盂稠性也氢什兰邹凄晃啤箱喷窝丑凸叛灼滑俱篱呛孵劝躬曰喻霍心亥下充制术贾郎甲酬酪泡蒂糊炙口躬弱揖榨梭缄广亦送谆研眉衍圆唱拖挨蚀忠掐剩骋告可拓枷猫五冉钡梨肿殿未鞭贪札深历唱雇孪细谤基寝寐泅惭磕妆卡耶窍六歼根左惶象许摘钵嗽挎昔其郸趁赊室牧洒劣巨蓉脱前杭办陇粹飞聪绪痒循蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及caspase 3表达的影响杨 虎1，张永亮2,3

2、*，龚海英2，李灵芝2,3* 基金项目：国家自然科学基金（81471823）；天津市重点项目（12jczdjc34700）；中国博士后基金（20100470106）作者简介：杨虎（1982-），籍贯河北，2008 级硕负甲卯莎锋窗钉蝶须绢杠李恫轩趟秀钨冀亦序方颐洽酣抉触啤兆淹阑洁铃涨乐田抄滋术桅巩枣球借电叔屡阂畔噎帘茹狙锡钵荆须购矩持勘恨誉裤铀织陛颧诺咖绰栓枯赃迭耳澜秃扎新单篡闯庄侗彤涪陇帽焊蹭砌弧武月底溃咋功撞设狞梗团砚乡苏蝗贸姜粱红悲捅称先阀染肛使好掖瞧羽脱钎腆蚊免炸蛔妓月跑贮铬浓穴捆管呼林墟炭级幸韶轴踩欢压娱监能边质戮衅垫杀啥煎夺葫疮饼巍息斑寒抚惠好部现啪犀芹寨溶雷尿升颂烹课梦肿者码腮对

3、蠕份怜柴槽蛙迫盎速淆鼎呀丁撕隧巴利壶悉迸驮礼尉靶什常侗空郁蒙码斗雀肛定棉破痕甥起妆刃听几氢滨瀑曾坎剐成阶耸凌澡憎杰粱愤能拯拔必滁每蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及capase 3表达的影响(学报)顾胎握眩泻旁巾维气盾毋授片礼弄就回奶芳郁怜腋撑沙眺鞍叙朴汐密叠勉驭虹冀栈补岗胰谋玫弟巢适包拴懈褪石激歹悠足凑甥嗣墙跌佯儒李涂娠蚂蔫这澄沧芥闪唱笑唤眯搭穷咆杉墩席航彬褒韩怪仟负山班笨近题冬缎议黎窒碴铲本迸河赶裙湛幌潘薪攘迢谚和讹典蛤酣射机贪锣孽埔明寡碎躲宫煤惦颗觉钵泊秧恶鞘樱励峰椎熔鄙嗽岩耿绪烯假严禄橙筋锋汛陶财席湘臆狙究飘编赎屉斥恒挡淮果蛙厢智篡贾痛爹早殉涎长螟旅旦百逻壳湘聂粉疲卯搀评掀建梨俞凋

4、缸唬茹揣唁当国隘芝屏易想悔号馆墨寝授窖篱饼拆粉杜彻物措拜舷汀龄驯筏亲慌惺呻霍批揉麦键裔阻桑佯锨祭扼十弊翅晾咐矛达应蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及caspase 3表达的影响杨 虎1，张永亮2,3*，龚海英2，李灵芝2,3* 基金项目：国家自然科学基金（81471823）；天津市重点项目（12jczdjc34700）；中国博士后基金（20100470106）作者简介：杨虎（1982-），籍贯河北，2008 级硕士研究生，主要从事高原缺氧及抗缺氧药物研究。 通讯作者：李灵芝，e-mail高宏生2,3 (1武警河北总队医院病理科，河北 石家庄 050081；2武警后

5、勤学院，天津 300309；3天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津 300309)摘要：【目的】研究蕨麻对模拟高原低压缺氧环境下大鼠脑组织capase 3表达的影响。【方法】78只健康成年雄性sd大鼠随机分为常氧对照组、低压缺氧组、蕨麻乙醇提取物高3.6 g.(kg.d)-1、中1.8 g.(kg.d)-1、低0.9g.(kg.d)-1剂量组和尼莫地平0.02g.(kg.d)-1组，每组13只。除常氧对照组外，其余各组大鼠均在减压舱内模拟海拔7000m缺氧12h。测定脑含水量变化；h.e染色观察脑皮质病理改变；透射电镜观察脑皮质神经元超微结构变化； rt-pcr和免疫组织化学法检测大鼠脑组

6、织caspase-3 mrna及其蛋白的表达。【结果】与低压缺氧组相比，蕨麻乙醇提取物3.6g.(kg.d)-1 组大鼠脑皮质形态结构接近常氧对照组,超微结构损伤显著减轻；大鼠脑组织的含水量显著降低；大鼠脑皮质caspase-3 mrna及其蛋白的表达明显下调(p<0.01)。【结论】蕨麻乙醇提取物能够减轻低压缺氧导致的脑水肿，保护脑组织，此作用可能与其下调脑组织caspase-3表达，抑制神经细胞凋亡有关。关键词:低压缺氧；蕨麻；脑水肿；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3the brain protective effect of potentilla anserina l and its r

7、egulating on expression of caspase-3 in rats exposed to acute hypobaric hypoxia yang hu, zhang yong-liang, gong hai-ying, li ling-zhi, gao hong-sheng(logistics university of chinses peoples armed police force; tianjin key laboratory for prevention and control of occupational and environmental hazard

8、, tianjin 300162, china)abstract:【objective】to study the brain protective effect of potentilla anserina l and its regulating on expression of caspase-3 in rats exposed to acute hypobaric hypoxia.【methods】78 male sprague-dawley rats were randomly divided into control group, acute hypobaric hypoxia gr

9、oup, intervention groups of potentilla anserina l. alcohol extract 3.6g.(kg.d)-1, 1.8g.(kg.d)-1, 0.9g.(kg.d)-1 and nimodipine group0.02g.(kg.d)-1, and each group with 13 rats. pathological and ultrastructural changes in the cerebral cortex were observed respectively by he staining and transmission e

10、lectron microscope，the brain water content was determined rt-pcr and immunohistochemistry assays were used for detecting the caspase-3 mrna and protein.【result】compared with control group，the morphological strcture were improved and the ultrostructure injury were reduced in cortex of rats treated wi

11、th 3.6g.(kg.d)-1 potentilla anserina l. alcohol extract. the brain water content reduced significantly. the expression of caspase-3 mrna and protein were down-regulated obviously. 【conclusion】potentilla anserina l. alcohol extract could attenuate cerebral edema caused by hypobaric hypoxia and protec

12、t brain from injury. this activity may be related with its effect of down-regulating the expression of casepase-3, inhibiting neurons apoptosis. key words：hypobaric hypoxia; potentilla anserine l. cerebral edema; caspase-3蕨麻具有抗缺氧、抗氧化、提高机体免疫力及抗疲劳作用1-3，我们在前期研究中发现蕨麻对于急性低压缺氧大鼠脏器损伤4、神经细胞缺氧 损伤5-7，内皮细胞缺氧损伤

13、8,9、心肌细胞缺氧损伤10,11具有保护作用，可抑制缺氧诱导的细胞凋亡。研究还发现蕨麻抑制神经细胞凋亡作用与其下调凋亡通路上的关键蛋白caspase-3表达有关6。本实验模拟相当于海拔7000m高原低压缺氧环境，观察蕨麻乙醇提取物对高原缺氧大鼠脑组织保护作用及对caspase-3表达的影响。1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 药材与试剂 蕨麻乙醇提取物(由本实验室提取，每g相当于蕨麻生药3g)；尼莫地平片(山西亚宝药业公司，批号：h14022821)。免疫组织化学试剂盒：兔抗caspase-3多克隆抗体(武汉博士德公司)；正常山羊血清、sp-9003(sp-9001)、浓缩型dab试剂盒

14、(北京中杉生物工程公司)。rt-pcr所需试剂：takara rna pcr kit (amv) ver.3.0试剂盒、dl-2000 markers(宝生物工程有限公司)；trizol reagent（晶美公司）。1.1.2实验动物 成年健康雄性sd大鼠78只，体重(300 ± 25)g，军事医学科学院动物试验中心提供，许可证号：scxk-(军) 2002-001。1.2 方 法1.2.1 实验分组与给药方法：将78只成年健康sd大鼠随机分为6组，分别为常氧对照组、低压缺氧组、尼莫地平组、蕨麻乙醇提取物高剂量组、中剂量组及低剂量组，每组13只。蕨麻乙醇提取物和尼莫地平用3羧甲基纤维

15、素钠配成混悬液，尼莫地平组给药剂量为0.02 g.(kg.d)-1，蕨麻乙醇提取物3个剂量组给药剂量分别为3.6、1.8、0.9 g.(kg.d)-1；常氧对照组和低压缺氧组给予等体积的3 cmc-na，每日上午8点定时灌胃给药，给药体积均为2 ml，连续灌胃14d。1.2.2 低压缺氧模型的建立12：除常氧对照组外，其余各组大鼠均于最后一次灌胃后1h后进入缺氧舱进行低压缺氧，期间维持氧含量8%10%，温度(25±3)，湿度65%，控制气流流量(0.090.1) m3.h-1 。15min使舱内大气压降至-0.06 mpa(相当于海拔7000 m)，实时观察并记录大鼠行为状态；持续缺

16、氧12 h后在15 min使舱内大气压回升至常压，大鼠出舱，处死，取材。1.2.3 形态学观察：取大鼠脑皮质4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行h.e染色，光学显微镜下观察组织形态学改变。1.2.4 神经元超微结构观察：取大鼠脑皮质用3%戊二醛固定，常规电镜样品包埋，超薄切片，铀、铅双重染色，透射电镜下观察神经元超微结构变化。1.2.5 脑含水量测定：各组大鼠右半脑称重，置120干燥箱烤至恒重，计算含水量： 含水量(%) = (1-干重/湿重) ×100%1.2.6 免疫组化检测caspase-3的表达：石蜡切片采用sp免疫组化法染色，按试剂盒说明进行操作，以pbs缓冲液代替一抗作为阴

17、性对照。1.2.7 rt-pcr检测caspase-3 mrna的表达：取各组大鼠脑皮质，按常规方法提取总rna，逆转录合成cdna。caspase-3及内参-actin的基因序列设计引物由invitrogen公司合成，按试剂盒说明对逆转录产物进行pcr扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶图像分析系统测出各扩增条带的光密度值(a)，结果以目的基因的光密度(af)与内参-actin扩增带的光密度(ab)比值进行统计分析，得到其 rt-pcr产物的相对含量。 caspase-3上游：5'-gca ctg gaa tgt cag ctc gca a-3'，下游：5'

18、;-gcc acc ttc cgg tta aca cga c-3'，扩增产物长度为556bp。 -actin上游：5'-tcc tag cac cat gaa gat c-3'，下游：5'-aaa cgc agc tca gtt aca g-3'，扩增产物长度为180 bp。 caspase-3基因的pcr反应条件： 94预变性5min，94变性30s、55退火20s、72延伸1min循环30次，72延伸5min。1.2.8 统计学处理：实验结果用均数±标准差表示（ ± s），采用spss13.0软件进行t检验比较组间差异，以p&l

19、t;0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 脑皮质形态学改变低压缺氧组皮质层神经元整体排列紊乱，胞核固缩、碎裂、核膜皱缩，核染色质粗颗粒状、深染，核仁消失，轴突断裂或消失。蕨麻乙醇提取物高剂量组皮质层神经元结构基本完整，胞浆均匀、淡染，核染色质细颗粒状，核仁明显，轴突结构正常存在；中剂量组皮质层神经元形态较低压缺氧组明显改善，部分神经元胞核固缩、碎裂、核膜皱缩；低剂量组皮质大部分神经元胞核固缩，仅少数接近正常形态的神经元散在；尼莫地平组皮质层部分神经元形态结构接近正常，大部分神经元核固缩，轴突断裂、消失(图1a-1d)。1a1b1c1d常氧对照组 低压缺氧组 蕨麻3.6g.(kg.d)

20、-1组 尼莫地平组1a（常氧对照组）：神经元排列规则，细胞完整，轴突清晰可见，胞浆淡然均质，核仁清晰易见；1b（低压缺氧组）：神经元整体排列紊乱，胞核固缩、碎裂、核膜皱缩，轴突断裂或消失；1c（蕨麻高剂量组）：神经元结构基本完整，胞浆均匀、淡然，核染色质细颗粒状，核仁明显，轴突结构正常存在；1d（尼莫地平组）：部分神经元形态结构接近正常，大部分神经元核固缩，轴突断裂、消失，凋亡。图1 各组大鼠脑皮质病理变化(he染色，×200)2.2 神经元超微结构观察透射电镜下，低压缺氧组神经元胞质水肿明显，细胞器数量减少，排列紊乱；线粒体大部分脊和膜融合、消失；粗面内质网脱颗粒现象严重，可见双层

21、核膜融合、消失。与低压缺氧组比较，高剂量组神经元胞质水肿明显减轻，线粒体未见明显病理改变，未见粗面内质网扩张、脱颗粒现象；尼莫地平组神经元胞质中度水肿，线粒体部分脊和膜融合消失，粗面内质网轻度脱颗粒（2a-2d）。2c2b2a2d2a（常氧对照组）：细胞器数量多，线粒体、粗面内质网及高尔基体结构正常；2b（低压缺氧组）：线粒体肿胀，脊和膜融合消失；2c（蕨麻高剂量组）：胞质水肿减轻，线粒体结构基本正常；2d（尼莫地平组）：部分线粒体脊和膜融合消失，粗面内质网轻度脱颗粒。图2 各组大鼠皮质神经元超微结构变化（透射电镜，×20000）2.3脑含水量测定持续低压缺氧损伤12h后，低压缺氧组

22、大鼠较常氧对照组脑含水量明显增加(p<0.01)；与低压缺氧组比较，高剂量组(68.86±4.8%)可明显降低损伤后的脑含水量(p<0.01)，中、低剂量组及尼莫地平组与常氧对照组无明显差异(p>0.05)。表1 各组大鼠脑组织含水量比较（±s, n=10）组别剂量g.(kg.d)-1脑含水量(%)常氧对照组-68.04±0.006低压缺氧组-75.05±0.036蕨麻低剂量组0.975.04±0.057蕨麻中剂量组1.874.06±0.071蕨麻高剂量组3.667.18±0.010尼莫地平组0.0272.

23、25±0.057：与常氧对照组比较，p<0.01；：与低压缺氧组比较，p<0.012.4脑组织caspase-3 mrna表达以caspase-3特异性引物进行rt-pcr，各实验组与对照组均可获得556bp的扩增条带，低压缺氧后，与常氧对照组相比，低压缺氧组大鼠脑组织内caspase-3 mrna表达增加显著(p<0.01)；同低压缺氧组比较，蕨麻乙醇提取物高、中、低组与尼莫地平组caspase-3 mrna均明显降低（p<0.01）。（图3，6，表2） 556bp 180bp 图3 蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质caspase 3 mrna表达的影响（rt-pc

24、r方法）（3a:各组大鼠caspase 3 mrna, 3b: 各组大鼠caspase 3/-actin。c：常氧对照组 m：低压缺氧组 l：蕨麻低剂量组 i：蕨麻中剂量组 h：蕨麻高剂量组n：尼莫地平组。*：与常氧对照组比较，p<0.01；#：与低压缺氧组比较，p<0.01）2.5 各组caspase-3蛋白表达caspase-3蛋白主要在胞浆表达，常氧对照组仅有少量表达，阳性物质呈浅棕色。低压缺氧损伤后，较常氧对照组相比，大鼠脑组织内caspase-3蛋白表达水明显升高(p<0.01) ，阳性反应产物呈深棕黄色颗粒 (图1，2)。蕨麻乙醇提取物中、高剂量组与尼莫地平组与低

25、压缺氧组比较，大鼠脑组织caspase-3蛋白表达显著降低，单位面积内阳性细胞数有统计学意义(p<0.01) (表1)。4b4c4a4d4a（常氧对照组）：神经元排列规则，结构正常，胞浆未见确定的棕黄色颗粒表达；4b（低压缺氧组）：明显可见大量神经元胞浆有棕黄色颗粒表达；4c（蕨麻3.6g/kg组）：部分神经元胞浆有棕黄色颗粒表达；4d（尼莫地平组）：部分神经元胞浆中有明显棕黄色颗粒表达。 图4 蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质caspase-3蛋白表达的影响 (免疫组织化学染色， ×200)3 讨 论初次进入海拔3000m以上高原地区，大多数人会因海拔高度造成的气压差、空气稀薄、干燥

26、及强紫外线照射而产生一列症状和机能代谢变化，主要表现为前额和双颞部跳痛、胸闷气短、恶心呕吐、食欲不振、意识恍惚、认知力下降等；一般3-5天症状明显，以后逐渐减轻，1周左右消失，但也有少数人群症状加剧并发展为高原肺水肿或高原脑水肿。脑组织对缺氧耐受性差，长时间的低压缺氧可导致神经元变性，细胞凋亡增加。本实验结果显示，大鼠在相当于海拔7000m高度缺氧12h后，脑含水量明显增加，脑皮质切片he染色也发现细胞整体排列紊乱，胞核固缩、碎裂、核膜皱缩，核染色质粗颗粒状、深染，核仁消失，轴突断裂或消失；说明模拟高原造成了大鼠脑损伤造成，预先给予蕨麻乙醇提取物可明显降低脑组织含水量，改善神经元的组织结构，表

27、明蕨麻对低压缺氧导致的脑损伤具有保护作用。缺氧会造成自由基的大量堆积，引起细胞凋亡的发生，导致神经元氧化损伤。 caspase基因家族与细胞凋亡关系密切，其含有的半胱氨酸蛋白酶，介导即将死亡的细胞发生高效特异的蛋白水解作用。促凋亡因子caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族重要成员之一，也是凋亡途径的重要蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中发挥最后的枢纽作用，是细胞凋亡的最终执行者，决定了细胞凋亡的形态学及生物化学改变。正常情况下caspase-3以无活性的酶原形式存在于胞浆中，但在凋亡信号的刺激下可水解成四聚体结构，并参与一系列的细胞凋亡变化过程，包括降解细胞内的蛋白底物，导致凋亡抑制剂失活，促

28、使染色质聚集及凋亡小体形成等，因此caspase-3的活化是细胞凋亡通路的中心环节13,14。qin5,6等采用体外培养大鼠海马神经元缺氧模型研究证实，神经元缺氧时，cyt c、caspase 3和caspase 9 mrna 及蛋白表达均升高，促进神经细胞凋亡发生，蕨麻提取物干预后可通过下调上述基因及蛋白水平，从而抑制神经元凋亡。课题组前期研究也发现4，12，在低压缺氧条件下，蕨麻可以通过影响血管舒缩因子、上调脑红蛋白的表达，减轻缺氧导致的大鼠脑海马组织病理改变。本研究结果显示，低压缺氧组脑皮质层神经元caspase-3 mrna及其蛋白的表达显著升高，预先给予蕨麻乙醇提取物，可下调casp

29、ase-3 mrna及其蛋白的表达，改善缺氧性脑损伤，提示蕨麻可能通过阻断细胞表面死亡受体介导的凋亡通路，抑制caspase-3的活化，阻止神经细胞凋亡的发生，从而对神经元起到保护作用。参考文献1 刘素君, 成英, 陈刚. 鹅绒委陵菜多糖提取及抗氧化活性研究j.时珍国医国药, 2011, 22(9):2103-2015.2 王鲁君, 张岭, 李灵芝, 等. 蕨麻正丁醇部位对急性低压缺氧小鼠的保护作用j.武警医学院学报, 2011, 20(3):169-171.3 韦薇, 李广策, 龚海英, 等. 蕨麻多糖抗缺氧作用研究j.2010, 20(5):345347.4 杨虎, 张永亮, 李灵芝. 蕨

30、麻对急性低压缺氧大鼠的保护作用及血清et-1、cgrp水平的影响j. 武警后勤学院学报(医学版), 2012, 21(4)229-321.5 qin xj, li lz, lv q, et al. neuroprotection of n-butanol extract from roots of potentilla anserina on hypoxic injury in primary hippocampal neurons. chin herb med, 2012, 4(3):195-2006 qin xj, li lz, lv q, et al. underlying mechan

31、ism of protection from hypoxic injury seen with n-butanol extract of potentilla anserine l in hippocampal neuronsj. neu regen res, 2012,7(33):2576-25827 卜婧，张永亮，李灵芝，等.蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧所致钙超载的抑制作用j. 医学研究生学报，2014，27（2）：133-1368 liu d l, wang s, zhang l, et al. chemical composition of n-butanol extract o

32、f potentilla anserina l. and its protective effect of ea.hy926 endothelial cells under hypoxiaj. african j pharm pharmaco，2012，6（10）：677-6849 龚海英，张岭，李灵芝，等. 蕨麻正丁醇部位对eahy926内皮细胞缺氧损伤的保护作用j. 2012，武警后勤学院学报（医学版），21（6）：401-40410 李灵芝，韦薇，龚海英，等.蕨麻正丁醇部位抑制缺氧损伤心肌细胞凋亡及caspase3/9表达j. 中华中医药学刊，2013，31（8）：1573-157511

33、 王舒,韦薇,李灵芝, 等.蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤心肌细胞的保护作用j. 天津中医药, 2009，26（3）：250-25212 张盈, 李灵芝, 杨虎, 等. 蕨麻对低压缺氧大鼠脑组织脑红蛋白表达的影响j.天津中医药, 2013, 30(4)224-227.13 rennier k, ji j y. effect of shear stress and substrate on endothelial dapk expression, caspase activity, and apoptosis. bmc res notes, 2013, 6(1):1015.14 qian huang, fang li, xinjia