细菌16S扩增详细步骤和注意要点

1、莇16S全长通用引物:芃8F莁 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG羇1492R螅 GGTTACCTTGTTACGACTT肂或蒁sgF莈 AGAGTTTGATCATGGCTCAG蒇sgR肅 TAGGGTTACCTTGTTACGACTT薀8F/1492R使用最普遍，效果的确不错；但我们的经验是sgF/sgR （上海生工公司扩 16S推荐的引物）效果更好。 这2对引物对应的 PCR产物都在1.5kb左右。蝿16SV6区通用引物：羅 V6-967F袄 CAACGCGAAGAACCTTACC蚀 V6-1046R膀 CGACAGCCATGCANCACCT蚇这对引物也是我们用过的，效果很好。对应的PC

2、R产物约90bp（ V6区平均长度80-100bp，说79bp）。蚃引物到后，先在迷你离心机上短暂离心，将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底，然后在超净台操 作個为16S序列所有细菌里都有， 扩增时很容易混入杂菌，因此本实验涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心，保证无污染）：按照引物合成单的说明，加入灭菌的TE缓冲液，如果没有，灭菌的双蒸水也行（注意每0D加入量不等于最终加入量，一般引物合成是20D。溶解核苷酸粉末后，用枪头吹吸混匀。取5卩L溶液转移到另一个灭菌的EP管，加入45卩L灭菌的双蒸水，即稀释 10倍，此时引物浓度为 10卩M也就是工作浓度。最好分装保 存，避免多次使用导致反复

3、冻融，造成引物不稳定。螀以genomicDNA为模板，最适模板量为 0.1-10ng，多了可能引发非特异性扩增，少了可能扩不出来，所以要先 稀释。PCF体系建议25卩L,效果远好于50卩L。推荐用TAKARA勺LATaq （保真度是普通 Taq的6.5倍，扩增效 率也较高）或 FINNZYMES勺Phusion （保真度是普通 Taq的50倍，pfu的6倍），以保证16S测序结果可信。薁PCR体系：肅模板1卩L蚆引物F0.5 L螀引物R0.5 i L螈 dNTP（ 10 mM） 0.5 1 L祎 LATaq (5U/ 1 L) 0.5 1 L蒅 10X PCRbuffer2.5 卩 L袀灭菌水

4、19.5（1 L膈总体积251 L薈模板1 i L膃引物F0.5 i L羀引物R0.5 i L i蕿 Phusion12.5 i L/"T/"； i-亠 | r z羆灭菌水10.5 i LL.1'羂总体积251 L肀注意：1、PCR加样过程要在超净台进行。操作前先开紫外灯30min，关闭后再开风机10min，再用酒精棉球清洁台面和双手，方可开始操作。羀2、一定要做阴性对照（不加模板，其余成分都加）！螈3、所用PCRt、枪头、水均须严格灭菌。羅4、加样过程中，每一管管盖开的时间不要太久，加完立刻扣上盖子，再加下一管，避免交叉污染（ge nomicDNA浓度通常很高，在

5、空气中容易逸散） 。 j腿5、加样在冰盒上操作，加完轻轻吹吸，短暂离心，保证各组分均匀混合。i'i 、£肇PCR程序：膆针对全长： | I螄 94C 4min艿94C 30s蒈65C40s-薃72C 90s薃 72 C 10min莆针对V6区: 薆 94C 4min94 C 30s3055 C 30s72 C 10s72 C 5min注意：Phusion的扩增效率较LATaq低，所以如果 Phusion扩不出，可适当增加 3-5个循环数。 电泳检测：配制1%（ 16S全长）或3%（V6区）琼脂糖凝胶一一样品PCR产物和阴性对照 PCR产物各取4卩L,混合0.5卩L6x loadingbuffer点样，并点 DL2000Marker （16S 全长）或 50bpladderMarker （V6 区）1x TAE 115V，电泳45-