《酶蛋白的化学修饰》ppt课件

1、第三章第三章 酶的化学修饰酶的化学修饰q酶的化学修饰酶的化学修饰Chemical modificationChemical modification是指用化学手段将某些原子或化学基团结是指用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改动，合到酶分子上，或将酶分子中某基团改动，从而到达改动酶的催化性质及一些生理生从而到达改动酶的催化性质及一些生理生化性质的目的。化性质的目的。q从酶动力学角度，酶的化学修饰过程为不从酶动力学角度，酶的化学修饰过程为不可逆抑制激活过程。可逆抑制激活过程。 q酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研讨，酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研讨，医药、农业、酶

2、工程、生化工程等领域。医药、农业、酶工程、生化工程等领域。化学修饰具有易实现，作用快，本钱低等化学修饰具有易实现，作用快，本钱低等优点，是一项常用的重要技术。优点，是一项常用的重要技术。例如：例如：1 1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的外表氨基、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的外表氨基，构成亲水性的，构成亲水性的NHCH2COOHNHCH2COOH后，该酶后，该酶对对6060C C热处置的稳定性增高了热处置的稳定性增高了10001000倍。倍。2 2、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide (superoxide dismutase, SOD)dismutase, SOD)、尿酸酶等用、尿

3、酸酶等用PEGPEG修饰修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被去除，减慢了它们在动物血液循环中被去除的速度，酶的活力可以保管的速度，酶的活力可以保管15154545。肽链：酶分子的骨架，构成根本的空间构造，肽链：酶分子的骨架，构成根本的空间构造，酶分子的根底。酶分子的根底。N端及端及C端：氨基和羧基有参与催化功能的能端：氨基和羧基有参与催化功能的能够。够。侧链基团：是构成活性中心特定构象和性质侧链基团：是构成活性中心特定构象和性质的组成部分，是完成催化反响的实践参与的组成部分，是完成催化反响的实践参与者。者。 对侧链基团进展化学修

4、饰是对侧链基团进展化学修饰是改造酶的性质和功能的重要手段。改造酶的性质和功能的重要手段。 着手蛋白质修饰任务时着手蛋白质修饰任务时, ,首先碰到的首先碰到的是修饰试剂和修饰条件的选择是修饰试剂和修饰条件的选择, ,以期提高以期提高修饰反响的专注性修饰反响的专注性, ,获得称心的修饰结果。获得称心的修饰结果。 实验目的不同,对专注性的要求也不同,因此,选择试剂在很大程度上要根据修饰目的。例如,对氨基的修饰有几种情况: 修饰一切氨基,而不修饰其他基团; 仅修饰-氨基; 修饰暴露的或反响性高的氨基 修饰具有催化活性的氨基等。 选择蛋白质修饰剂要思索的问题选择蛋白质修饰剂要思索的问题:修饰反响要完成到

5、什么程度修饰反响要完成到什么程度;对个别氨基酸残基能否专注对个别氨基酸残基能否专注;在反响条件下在反响条件下,修饰反响有没有修饰反响有没有限制限制;修饰后蛋白质的构象能否根本修饰后蛋白质的构象能否根本坚持不变坚持不变;能否需求分别修饰后的衍生物能否需求分别修饰后的衍生物;反响能否需求可逆；反响能否需求可逆；能否建立快速、方便的分析方能否建立快速、方便的分析方法等。法等。 特别留意：特别留意： 修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下特征具备以下特征:选择性地与一个氨基酸残基反响选择性地与一个氨基酸残基反响;反响在酶蛋白不变性的条件下进展反响在酶蛋白不变性的条

6、件下进展;标志的残基在肽中稳定标志的残基在肽中稳定,很易经过降解分很易经过降解分别出来别出来,进展鉴定进展鉴定:反响的程度能用简单的技术测定。反响的程度能用简单的技术测定。 除允许修饰能顺利进展外除允许修饰能顺利进展外,还必需满足还必需满足如下要求：如下要求：不呵斥蛋白质的不可逆变性。不呵斥蛋白质的不可逆变性。有利于专注性修饰蛋白质。有利于专注性修饰蛋白质。 为此为此,反响条件应尽能够在保证蛋白质特反响条件应尽能够在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进展。反定空间构象不变或少变的情况下进展。反响的温度、响的温度、pH都要小心控制。反响介质和都要小心控制。反响介质和缓冲液组成也要有所思索。

7、缓冲液组成也要有所思索。 专注性非常重要。除控制反响条件外,还可利用其他途径来实现修饰的专注性。利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用,迅速导致酶失活。但DFP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。这种景象称为位置专注性,由于这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决议的。 选择不同的反响选择不同的反响pH pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)(pKa)是不同的。所以控制不同的反响是不同的。所以控制不同的反响pHpH，也就控制了各功能基的解离程度也就控制了各功能基的解离程度

8、, ,从而有从而有利于修饰的专注性。利于修饰的专注性。例如：例如： 碘代乙酸对蛋白质进展修饰时碘代乙酸对蛋白质进展修饰时,试试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及酸的侧链及-氨基、氨基、-氨基发生作氨基发生作用。用。利用某些产物的不稳定性利用某些产物的不稳定性亲和标志亲和标志差别标志差别标志利用蛋白质形状的差别利用蛋白质形状的差别 吲哚基胍基 1修饰羧基三类修饰剂修饰羧基三类修饰剂 1) 碳二亚胺类碳二亚胺类 + 2) 甲醇甲醇 + CH3OH HCl +H2O3硼氟化三甲烊盐硼氟化三甲烊盐 CH33 OBF4 + + H B F 4 + CH3OCH32修饰

9、氨基四类修饰氨基四类 赖氨酸氨基有很高的亲核反响性，可赖氨酸氨基有很高的亲核反响性，可用多种酰基化试剂或烷基化试剂对其修用多种酰基化试剂或烷基化试剂对其修饰饰 1 烷基化烷基化2酰基化酰基化乙酸酐：乙酸酐：丹磺酰氯丹磺酰氯DNS：3复原烷基化复原烷基化4一个常用的特异修饰赖氨酸氨基的一个常用的特异修饰赖氨酸氨基的试剂：磷酸吡哆醛试剂：磷酸吡哆醛3修饰胍基修饰胍基 两类两类1二酮：二酮： 丁二酮：丁二酮： 环己二酮：环己二酮： 2苯乙二醛：苯乙二醛： 4修饰巯基四类修饰巯基四类 巯基是活性部位最常出现的基团，也巯基是活性部位最常出现的基团，也是有最多修饰剂的基团。巯基修饰剂可是有最多修饰剂的基团

10、。巯基修饰剂可分为以下四类：二硫键交换，烷基化，分为以下四类：二硫键交换，烷基化，酰基化，重金属化合物。酰基化，重金属化合物。 1二硫键交换：二硫键交换： ESH + RSSR ESSR + RSH ESH + ESSR ESSE + RSH 与与SH进展二硫键交换后，进展二硫键交换后，SH被修饰，被修饰，试剂的另一半以单体放出。试剂的另一半以单体放出。常用的二硫键交换试剂：常用的二硫键交换试剂：DTNB， 5, 5-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate) 二硫二吡啶，二硫二吡啶，4, 4-dithiodipyridine 或或2, 2-dithiodipyridine 二硫

11、键交换产生的单体在一定波长下有二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大光吸收，可用分光光度法定量延续很大光吸收，可用分光光度法定量延续监测。监测。2 2重金属化合物：重金属化合物：对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸PCMBPCMB E ESH + SH + HCl HCl2-2-氯汞氯汞- 4- 4-硝基酚硝基酚 E ESH + SH + + HCl+ HCl3 3烷基化：烷基化： E-SH + R-X E-SR +HX E-SH + R-X E-SR +HX常用烷基化试剂：常用烷基化试剂： 碘 代 乙 酰 胺 碘 代 乙 酰 胺 I A MI A M 碘代乙酸碘代乙酸 IAAIAA 一个常用的专注修饰巯

12、基试剂：一个常用的专注修饰巯基试剂： N- N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺NEMNEM: : E ESH SH 4 4酰基化：酰基化： O OE ESH SH E-S-C- E-S-C-R + HXR + HX5修饰咪唑基两种 通常经过对咪唑基上氮原子酰基化或烷基化修饰组氨酸咪唑基。1) 焦碳酸二乙脂diethyl paracarbonate是最常用的一个试剂： + +C2H5OH +CO2 2) 碘代乙酸： +ICH2COOH + HI 6 6吲哚基的化学修饰吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反响：氧化反响修饰反响：氧化反响 修饰剂：修饰剂： N- N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀

13、酰亚胺7修饰酪氨酸残基三种修饰酪氨酸残基三种 1碘化反响：碘化反响： I2 + HI 2硝化：硝化： NO2)4C+ +(NO2)3CH 3N-乙酰咪唑: N-ethyl imidazole 氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-

14、乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂域有着广泛的运用前景。1聚乙二醇聚乙二醇polyethylene glycol, PEG 聚乙二醇是一个线性分子，有良好的聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容性，在体内不残留，无毒，无生物相容性，在体内不残留，无毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。抗原性，是一种优良修饰剂。 其修饰方法有多种，如三氯均嗪法

15、、其修饰方法有多种，如三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法等。叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法等。 三氯均嗪法是一个常用的方法。三氯三氯均嗪法是一个常用的方法。三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代。均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代。三个氯原子反响性依次下降。三个氯原子反响性依次下降。2右旋糖酐右旋糖酐 右旋糖酐是由右旋糖酐是由-葡萄糖经葡萄糖经-1，6糖酐糖酐键构成的多糖，有较好的水溶性及生物键构成的多糖，有较好的水溶性及生物相容性，可用作代血浆。相容性，可用作代血浆。 右旋糖酐链上的双羟基构造经活化后右旋糖酐链上的双羟基构造经活化后可与酶上的自在氨基相结合。可与酶上的自在氨基相结合。 溴化氰

16、法是右旋糖酐修饰酶分子的常溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下活化，用方法。邻双羟基在溴化氰作用下活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反响，共价结合。响，共价结合。3肝素肝素 肝素有抗凝血、抗血栓、降血肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性，适于修饰溶栓酶类以添加脂活性，适于修饰溶栓酶类以添加疗效。疗效。碳二亚胺法碳二亚胺法5 5白蛋白白蛋白碳二亚胺法碳二亚胺法亲和标志亲和标志 (Affinity Labeling 亲和标志是最有意义的一种化学修饰，这是亲和标志是最有意义的一种化学修饰，这是由于它可以很专注性地作用于酶的活性部位。由于它可

17、以很专注性地作用于酶的活性部位。亲和标志是分步反响，修饰剂先可逆地结合在亲和标志是分步反响，修饰剂先可逆地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基团，普通是必需基团，而呵斥不可逆失活。亲团，普通是必需基团，而呵斥不可逆失活。亲和标志修饰剂普通是底物类似物，和底物含有和标志修饰剂普通是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团。共同的结合于酶的基团。 作用于组氨酸侧链的试剂作用于组氨酸侧链的试剂TPCKTPCK和和TLCKTLCK是是一个典型例子一个典型例子 TPCK TPCK TLCKTLCK 亲和标志试剂在酶上具有特定结合部亲和标志试剂在酶上具有

18、特定结合部位，其解离常数也易于测定，可以提供位，其解离常数也易于测定，可以提供酶的构造信息，是实际研讨中的一类常酶的构造信息，是实际研讨中的一类常用的修饰剂。用的修饰剂。 亲和标志试剂普通可以在较低浓度下亲和标志试剂普通可以在较低浓度下有效修饰酶，改动酶的活性，特别是专有效修饰酶，改动酶的活性，特别是专注性较强，是药物等的优良候选者，有注性较强，是药物等的优良候选者，有广泛的运用价值。广泛的运用价值。酶经过化学修饰后会产生的变化：酶经过化学修饰后会产生的变化：1.提高生物活性；提高生物活性；2.加强在不良环境中的稳定性；加强在不良环境中的稳定性；3.针对特异性反响降低生物识别才干，解针对特异性反响降低生物识别才干，解除免疫原性；除免疫原性；4.产生新的催化才干。产生新的催化才干。在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延伸它在体