实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白ppt课件

1、动物医学院动物生化教研室动物医学院动物生化教研室n掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理；掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理；n学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；n了解血清蛋白的主要成份。了解血清蛋白的主要成份。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 不延续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品经过浓缩胶的浓缩按分子大不延续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品经过浓缩胶的浓缩按分子大小陈列成层，然后进入分别胶，随着电泳的不断进展，不同大小、电荷的蛋白小陈列成层，然后进入分别胶，随着电泳的不断进展，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。质分子逐渐被分开。 B

2、is将单体长链连成网状构造将单体长链连成网状构造TEMED催化催化AP生成硫酸自在基生成硫酸自在基1、聚丙烯酰胺凝胶生成、聚丙烯酰胺凝胶生成催化催化AcrAcr聚合生长链聚合生长链Acr：丙烯酰胺：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸胺催化剂：过硫酸胺催化剂TEMED： N, N, N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺加速剂加速剂Acr、Bis决议孔径大小决议孔径大小AP、TEMED决议聚合速度决议聚合速度n 延续胶电泳延续胶电泳n 采用一样孔径的凝胶和一样的缓冲系统样品缓冲液、凝胶采用一样孔径的凝胶和一样的缓冲系统样品缓冲液、凝胶缓冲液缓冲液n 和电极缓冲液，在和电极缓冲液

3、，在pH恒定、离子强度一样的条件下进展。恒定、离子强度一样的条件下进展。n 优点：优点：n 制胶简单、快捷制胶简单、快捷n 缓冲液缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改动发生的凝聚值改动发生的凝聚和沉淀和沉淀n 缓冲系统组成简单，来源广泛缓冲系统组成简单，来源广泛n 缺陷：缺陷：n 分辨率不高分辨率不高2、延续胶和不延续胶电泳、延续胶和不延续胶电泳n 不延续胶电泳不延续胶电泳n 采用不一样孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳采用不一样孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分别过程中，由分别过程中，由n 于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分别胶界

4、面上先浓缩于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分别胶界面上先浓缩成一窄带，然后成一窄带，然后n 在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进展分别。在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进展分别。n 优点：优点：n 分辨率高分辨率高n 用于复杂和特殊样品的分别用于复杂和特殊样品的分别l 不延续电泳的三种物理效应不延续电泳的三种物理效应l 样品的浓缩效应样品的浓缩效应l 凝胶的分子筛效应凝胶的分子筛效应l 电荷效应电荷效应 电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及外形按一定的顺序分使样品各组分按照带电量、分子质量及外形按一定

5、的顺序分别。别。l不延续电泳的四种不延续体系不延续电泳的四种不延续体系l凝胶的不延续凝胶的不延续l缓冲液成份的不延续缓冲液成份的不延续l缓冲液缓冲液pH值的不延续值的不延续l电压梯度的不延续电压梯度的不延续三、实验步骤三、实验步骤n封槽封槽n 清洁、枯燥的小玻管一端，用清洁、枯燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后贴封后垂直放在管架上垂直放在管架上 n分别胶：分别胶：A:C:D:E1:2:3:2V/Vn浓缩胶：浓缩胶：B:C:D:E2:1:5:2V/VnA: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液缓冲液nB: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液缓冲液nC: 30% Acr-Bis储存液储存液nD

6、: 水水nE: 过硫酸铵过硫酸铵 灌装前参与灌装前参与TEMED，混匀，混匀 取干净玻璃管，下端封口膜封好重要；用注射器加分别胶至管口取干净玻璃管，下端封口膜封好重要；用注射器加分别胶至管口1-1-2cm2cm处，封水沿管壁，动作要慢；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口处，封水沿管壁，动作要慢；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm2-3mm处、封水；凝固后备用。处、封水；凝固后备用。制胶和灌胶制胶和灌胶n加样加样n 用微量注射器取样品液用微量注射器取样品液15l，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。浓缩胶面上，缓慢注入。n电泳电泳n衔接电极，上负下正；衔接电极，上负下正；n浓缩胶：浓缩胶：3mA管，分别胶：管，分别胶：4mA管；管；n待示踪染料接近凝胶管底部约待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。处，切断电源。n剥胶剥胶n染色染色n 将凝胶柱置于将凝胶柱置于0.05%氨基黑氨基黑10B溶液中浸染溶液中浸染20min，然后再浸入，然后再浸入7%醋酸溶液中醋酸溶液中 脱色。脱色。n 血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。带。 分别胶和浓缩胶中分别胶和浓缩胶中A,B,C,D,EA,B,C,D,E各是什么组分。各是什么组分。 分别胶和浓缩胶中缓冲液的组分，分别胶和浓缩胶