菌体浓度对发酵的影响

1、、菌体浓度对发酵的影响及控制菌体(细胞)浓度 (cellconcentration) 是指单位体积培养液中菌体的含量。无论在科 学研究上 .还是在工业发酵控制上 .它都是一个重要的参数。 菌浓的大小 . 在一定条件下 .不仅 反映菌体细胞的多少 . 而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研 究中 . 需要利用菌浓参数来算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数.以研究它们之间的相互关系 . 探明其动力学规律 . 所以菌浓仍是一个基本参数。菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系。比生长速率大的菌体菌浓增长也迅速反之就缓慢。而菌体的生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性

2、有关. 不同种类的微生物的生长速率是不一样的。 它的大小取决于细胞结构的复杂性和生长机制 细胞结构越复杂 分裂所需的 时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min、90min、3h 和6h左右这说明各类微生物增殖速率的差异。菌体的增长还与营养物质和环境条件有密切关系。营养物质包括各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。按照Monod方程式来看生长速率取决于基质的浓度(各种碳源的基质饱和系数Ks在110mgT L之间).当基质浓度c(S)>1OKs时.比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度在此限度以内菌体比生长速率则随基质浓度增加而增加 但超过此上限 基

3、质浓度继续增加 反而会引起生 长速率下降。这种效应通常称为基质抑制作用。这可能是由于高浓度基质形成高渗透压 引起细胞脱水而抑制生长。 这种作用还包括某些化合物 (如甲醇、苯酚等)对一些关键酶的抑制 或使细胞结构成分发生变化。一些营养物质的上限浓度(g / L)如下：葡萄糖100、NH4+5PO43-10。在实际生产中常用丰富培养基促使菌体迅速繁殖菌浓增大引起溶氧下降。所 以在微生物发酵的研究和控制中营养条件(含溶氧)的控制至关重要。影响菌体生长的环境 条件有温度、 pH 值、渗透压和水分活度等因素。菌浓的大小 对发酵产物的得率有着重要的影响。 在适当的比生长速率下 发酵产物的产 率与菌浓成正比

4、关系 即P=QPmc(X)式中P发酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率 ).g /(L h);QP产物最大比生成速率 h-l ;c(X) 菌体浓度 g L。菌浓愈大 产物的产量也愈大 如氨基酸、 维生素这类初级代谢产物的发酵就是如此。 而 对抗生素这类次级代谢产物来说控制菌体的比生长速率卩比卩临略高一点的水平达到最适菌浓即c(X)临菌体的生产率最高。但是菌浓过高则会产生其他的影响营养物质消耗过快培养液的营养成分发生明显的改变有毒物质的积累就可能改变菌体的代谢途径特别是对培养液中的溶氧 影响尤为明显。菌浓增加而引起的溶氧下降 会对发酵产生各种影 响。早期酵母发酵 会出现代谢途径改变、 酵母生长

5、停滞、 产生乙醇的现象； 抗生素发酵中 也受溶氧限制使产量降低。如图 7-7.为了获得最高的生产率需要采用摄氧速率 OUR与传 氧速率OTR 相平衡时的菌体浓度也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化 的曲线的交点所对应的菌体浓度 即临界菌体浓度 c(X) 临。菌体超过此浓度 抗生素的比生 成速率和体积产率都会迅速下降。c(X)警c(X)图7-7摄氧速率OUF曲线与传氧速率OTR曲线关系示意图发酵过程中除要有合适的菌浓外还需要设法控制菌浓在合适的范围内。菌体的生长速率.在一定的培养条件下主要受营养基质浓度的影响所以要依靠调节培养基的浓度来控制 菌浓。首先要确定基础培养基配方中有适当的

6、配比避免产生过浓（或过稀）的菌体量。然后通过中间补料来控制如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时则可补加一部分磷酸盐促进生长.提高菌浓；但补加过多则会使菌体过分生长超过c（X）临.对产物合成产生抑制作用。在生 产上.还可利用菌体代谢产生的 CO2量来控制生产过程的补糖量.以控制菌体的生长和浓度。 总之.可根据不同的菌种和产品采用不同的方法来达到最适的菌浓。基质对发酵影响及其控制基质即培养微生物的营养物质。对于发酵控制来说基质是生产菌代谢的物质基础 既涉及菌体的生长繁殖又涉及代谢产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的 关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度是提高代谢产物产量的重要方法。据M

7、onod方程.在分批发酵中菌体比生长速度是基质浓度的函数。在c（S）<<Ks的情况下菌体比生长速率与基质浓度呈线性关系。在正常的情况下可达到菌体最大比生长速率 然而.由于代谢产物及其基质过浓 而导致抑制作用出现菌体比生长速率下降的趋势。当葡萄糖浓度低于100150g/ L.不出现抑制作用；当葡萄糖浓度高于350500g/ L.多数微生物不能生长.细胞出现脱水现象。就产物的形成来说培养基过于丰富有时会使菌体生长过旺黏度增大传质差菌体不 得不花费较多的能量来维持其生存环境即用于非生产的能量大量增加。所以.在分批发酵中控制合适的基质浓度不但对菌体的生长有利对产物的形成也有益处。 这里要着

8、重说明碳源、氮源和无机盐等对发酵的影响及其控制。1碳源对发酵的影响及其控制碳源按菌体利用快慢而言分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。前者（如葡萄糖）能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量并产生分解代谢产物（如丙酮酸等）.因此有利于 菌体生长但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；后者多数为聚合物（也有例外）.为菌体缓慢利用有利于延长代谢产物的合成特别有利于延长抗生素的生产期也为许多微生物药物的发酵所采用。例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油及半乳糖分别是青霉素、头孢菌素C盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。因此选择最适碳源对提高代谢产物 产量是很重要的。在青霉素的早期研究中就认识到了碳源的

9、重要性。 在迅速利用的葡萄糖培养基中菌体 生长良好但青霉素合成量很少；相反在缓慢利用的乳糖培养基中青霉素的产量明显增加。 糖对青霉素生物合成的影响见图7-8。由图可见糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。所以缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖仍然可以得到良好的结果。这就说明乳糖之所以是青霉素发酵的良好碳源并不是它起着前体作用只是它被缓慢利用的速度恰好适合青霉素合成的 要求.其他抗生素发酵也有类似情况。在初级代谢中也有类似情况 如葡萄糖完全阻遏嗜热脂肪芽孢杆菌产生胞外生物素（属同效维生素.vitamer.化学构造及生理作用与天然维生素相 类似的化合物）的合成。因此.控制使用能产生阻遏作用的迅速利用的碳源是非

10、常重要的。在工业上发酵培养基中常采用含迅速利用和缓慢利用的混合碳源就是根据这个原理来控制菌体的生长和产物的合成。.时何巾图7-8糖对青霉素生物合成的影响试验碳源的浓度也有明显的影响。由于营养过于丰富所引起的菌体异常繁殖对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大.则产物的合成会受到明显的抑制；反之仅仅供给维持量的碳源菌体生长和产物合成就都停止。所以控制合适的碳源浓度是非常重要的。如在产黄青霉 Wis54-1255发酵中.给以维持量的葡萄糖其比消耗速率0.022g /（g h）.菌的比生长速率和青霉素的比生成速率都为 零.所以必须供给适量的葡萄糖.

11、方能维持青霉素的合成速率。因此.控制适当的碳源浓度.对工业发酵是很重要的。控制碳源的浓度.可采用经验法和动力学法.即在发酵过程中采用中间补料的方法来控制。这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。动力学方法是要根据菌体 的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。2氮源对发酵的影响及其控制 氮源有无机氮源和有机氮源两类。它们对菌体代谢都能产生明显的影响 . 不同的种类和 不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。如谷氨酸发酵当NH4供应不足时.就促使形成a -酮戊二酸；过量的NH4+.反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。控制适量的NH44浓度.才能使谷氨酸产量达到最大。

12、又如在研究螺旋霉素的生物合成中 发现无机铵盐不利于螺旋霉素 的合成 而有机氮源 （如鱼粉 ） 则有利于其形成。氮源像碳源一样 也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。前者如氨基（或铵 ）态氮的氨基酸 （或硫酸铵等 ）和玉米浆等； 后者如黄豆饼粉、 花生饼粉、 棉子饼粉等蛋白质。 它们各有 自己的作用 快速利用的氮源容易被菌体所利用 促进菌体生长 但对某些代谢产物的合成 特别是某些抗生素的合成产生调节作用 影响产量。 如链霉菌的竹桃霉素发酵中 采用促进菌 体生长的铵盐浓度 能刺激菌丝生长 但抗生素产量下降。铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、 泰洛星等的合成产生调节作用。 缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物

13、的生产期、 提高产物的 产量是有好处的。 但一次投入全量 也容易促进菌体生长和养分过早耗尽 以致菌体过早衰老 而自溶 从而缩短产物的生产期。 综上所述 对微生物发酵来说 也要选择适当的氮源和浓度。发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐（ 硫酸铵或醋酸铵 ） 和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单 一的铵盐或有机氮源 （如黄豆饼粉 ）。它们被利用的情况与快速利用和慢速利用的碳源情况相 似。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶 除了基础培养基中的氮源外 还要在发酵过程中 补加氮源来控制其浓度。生产上采用的方法有如下几种。补加有机氮源根据产

14、生菌的代谢情况 可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作 用的有机氮源 如酵母粉、 玉米浆、 尿素等。 如土霉素发酵中 补加酵母粉 可提高发酵单位； 青霉素发酵中 后期出现糖利用缓慢、菌浓变稀、 pH 值下降的现象 补加生理碱性物质的尿 素就可改善这种状况并提高发酵单位；氨基酸发酵中也可补加作为氮源和 pH值调节剂的尿素。补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源又可调节 pH 值。在抗生素发酵工业中 通氨是提高发酵产量的有效措施 如与其他条件相配合 有的抗生素的发酵单位可提高 50左右。但当 pH 值偏高而又需补氮时 就可补加生理酸性 物质的硫酸铵以达到提高氮含量和

15、调节 pH值的双重目的。还可补充其他无机氮源但需根据发酵控制的要求来选择。3磷酸盐对发酵的影响及其控制磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分 也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好 所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmol/ L.但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为10mmol/ L.提高到10mmol/ L.就明显地抑制其合成。相比之下 菌体生长所允许 的浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度就大得多 两者平均相差几十倍至几百倍。因此控 制磷酸盐浓度对微生物次级代谢产物发酵来说是非常重要的。磷酸盐浓度调节代谢产物合成机制 对于初级代谢产物合成的影响 往往是通过促进菌体生长而间接产生的

16、 对于次级代谢 产物来说 机制就比较复杂。磷酸盐浓度的控制 一般是在基础培养基中采用适当的浓度。 对于初级代谢来说 要求不 如次级代谢那么严格。 对抗生素发酵来说 常常是采用生长亚适量 （对菌体生长不是最适合但 又不影响生长的量 ）的磷酸盐浓度。其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和 来源等因素 即使同一种抗生素发酵 不同地区不同工厂所用的磷酸盐浓度也不一致 甚至相 差很大。因此磷酸盐的最适浓度 必须结合当地的具体条件和使用的原材料进行实验确定。 培养基中的磷含量 还可能因配制方法和灭菌条件不同 引起含量的变化。据报道 利用金霉素链霉菌949(S.aureofaciens949) 进

17、行四环素发酵菌体生长最适的磷浓度为6570卩g/mL.而四环素合成最适磷浓度为2530卩g/mL。青霉素发酵.以用0.01 %的磷酸二氢钾为好。在发酵过程中 . 有时发现代谢缓慢的情况 . 还可补加磷酸盐。在四环素发酵中 . 间歇、微 量添加磷酸二氢钾 . 有利于提高四环素的产量。除上述主要基质外.还有其他培养基成分影响发酵。如Cu2+.在以醋酸为碳源的培养基中.能促进谷氨酸产量的提高；Mn2+对芽孢杆菌合成杆菌肽等次级代谢产物具有特殊的作用.必须使用其足够的浓度才能促进杆菌肽的合成等。总之. 发酵过程中 . 控制基质的种类及其用量是非常重要的 . 是发酵能否成功的关键 . 必 须根据产生菌的

18、特性和各个产物合成的要求 . 进行深入细致的研究 . 方能取得良好的结果。第六节CO2和呼吸商二氧化碳(CO2)是微生物的代谢产物.同时.它也是合成产物所需的一种基质。对微生物生长和发酵具有刺激作用.它是细胞代谢的可贵指标。有人把细胞量与累积尾气CO2生成关联.把CO2生成作为一种手段.通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量。溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有抑制和刺激作用.对许多产物的生产菌亦有影响。一、CO2对菌体生长和产物形成的影响CO2对菌体的生长有直接作用.引起碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。大量实验表明.CO2对生产过程具有抑制作用。当CO2分压为0.

19、008MPa时.青霉素合成速度降低40%;发酵液中溶解 CO2浓度为1.6 X 10-2mol / L时.会严重抑制酵母生长。当进气口CO2含量占混合气体体积的80%时.酵母活力只达到对照组的80%。一般以1L/(L min)的空气流量通气发酵.发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10%。当微生物生长受到抑制时.也阻碍了基质的异化(或分解代谢)和ATP的生成量.由此而 影响产物的合成。在氨基糖苷类抗生素紫苏霉素 (sisomycin) 生产中 . 在 300L 发酵罐于空气 进口通以1%CO2.发现微生物对基质的代谢极慢.菌丝增长速度降低.紫苏霉素的产量比对照组降低33%。通入2% CO2紫苏霉

20、素的产量比对比照组降低85% .CO2的含量超过3% .则不产生紫苏霉素。CO2会影响产黄青霉菌(penicilliumchrysogenum) 的形态。研究者将产黄青霉菌接种到 溶解不同CO2浓度的培养基中.发现菌丝形态发生变化。CO2分压08%时.菌丝主要是丝状； CO2分压15%22 %.则膨胀.粗短的菌丝占优势；CO2为0.008MPa时.则出现球状或酵母状 细胞 . 致使青霉素合成受阻 . 其比生成速率降低 40%左右。CO2对细胞作用机制是怎样的呢？ CO2及 HCO3都会影响细胞膜结构.它们分别作用于细 胞膜的不同位点。CO2主要作用在细胞膜的脂肪核心部位。 HCO3则影响磷脂.

21、亲水头部带电 荷表面及细胞膜表面的蛋白质。当细胞膜的脂质相中CO2浓度达临界值时.使膜的流动性及表面电荷密度发生变化 . 这将导致许多基质的膜运输受阻 . 影响细胞膜的运输效率 . 使细胞处 于“麻醉”状态 . 细胞生长受到抑制 . 形态发生改变。CO2对发酵的影响很难进行估算和优化.估计在大规模发酵中 CO2的作用将成为突出的问题。因发酵罐中 CO2的分压是液体深度的函数.10m深的发酵罐在0.101MPa气压下操作. 底部CO2分压是顶部CO2分压的2倍。为了排除 CO2的影响.必须考虑CO2在培养液中的溶 解度、温度及通气情况。CO2溶解度大.对菌生长不利。二、CO2的释放率分析尾气中C

22、O2的含量.记录培养基体积及通气量的变化 .用计算机计算CO2的积累量. 与培养基培养菌体的干重比较 .得出对数期菌体生长速率与 CO2释放率成正比关系(一般空 气进口 O2占20.85 %、CO2占0.03 %、惰性气体 79.12 %)。如果连续测得排气氧和 CO2浓度.可计算出整个发酵过程中C02的释放率（Carbondioxidereleaseratio. 简称CRR。C RR Qc()e(X)2式中:定八二氧化碳比释放率.mmolCO2/（g干菌体 h）;c（X）发酵液中菌体的浓度.g干菌体/ L。三、呼吸商与发酵的关系发酵过程中菌的耗氧速率OUF可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量进气和

23、排气中的氧含量计算而得并最终计算出呼吸商 RQRQ =:RROURRQ可以反映菌的代谢情况 酵母发酵.RQ=1.糖有氧代谢仅生成菌体无产物形成； RQ>1.1.糖经EMP生成乙醇。不同基质.菌的RQ不同。E.coli以延胡索酸为基质.RQ=1.44 ; 以丙酮酸为基质.RQ=1.26 ;以琥珀酸为基质.RQ=1.12 ;以乳酸、葡萄糖为基质.RQ分别为1.02 和 1.00。在抗生素发酵中由于存在菌体生长、维持及产物形成的不同阶段其RQ值也不一样。青霉素发酵的理论呼吸商：菌体生长0.909.菌体维持1.青霉素合成4。从上述情况看.发酵早期.主要是菌生长.RQ<1;过渡期菌体维持其生

24、命活动.产物逐渐形成.基质葡萄糖的代谢不 仅仅用于菌体生长.RQ比生长期略有增加。产物形成对RQ的影响较为明显.如产物还原性比 基质大.RQ增加；产物氧化性比基质大.RQ就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质 所形成的产物量。实际生产中测定的RQ值明显低于理论值.说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和除葡萄糖以外的其他碳源。如发酵过程中加入消泡剂.由于它具有不饱和性和还原性 . 使RQ值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ值。如试验结果表明青霉素发酵中.RQ为0.50.7之间.且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动。RQ是碳-能源代谢情况的指示值。在碳 -能源限制及供氧充分的情况下 .碳-能源趋向

25、于 完全氧化.RQ应达到完全氧化的理论值 .见表7-1。如果碳-能源过量及供氧不足.可能出现碳 -能源不完全氧化的情况.从而造成RQ异常。表7-1 一些碳-能源基质的理论呼吸商碳施源呼吸商1碳能源呼（ft商1.0乳簟1.0甘油0.86甲烧0-5植物油0.7甲壽佔|四、CO2浓度的控制CO2在发酵液中的浓度变化不像溶氧那样.没有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响.如菌体的呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小等因素。设备 规模大小也有影响.由于CO2的溶解度随压力增加而增大.大发酵罐中的发酵液的静压可达 0.1MPa以上.又处在正压发酵.致使罐底部压强可达 0.15MPa。因

26、此CO2浓度增大.如不提高 搅拌转数.CO2就不易排出.在罐底形成碳酸.进而影响菌体的呼吸和产物的合成。为了控制 CO2的不良影响.必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度和通气情况。在发酵过程中.如遇到泡沫上升而引起“逃液”时 采用增加罐压的方法来消泡。但这样会增加C02的溶解度.对菌体生长是不利的。C02浓度的控制应随它对发酵的影响而定。如果C02对产物合成有抑制作用.则应设法降低其浓度； 若有促进作用 . 则应提高其浓度。 通气和搅拌速率的大小 . 不但能调节发酵液中 的溶解氧还能调节 C02的溶解度.在发酵罐中不断通入空气既可保持溶氧在临界点以上 又可随废气排出所产生的 C02使之低于能

27、产生抑制作用的浓度。因而通气搅拌也是控制 C02浓度的一种方法降低通气量和搅拌速率有利于增加C02在发酵液中的浓度；反之就会减小 C02浓度。在3m3发酵罐中进行四环素发酵试验 发酵40h以前通气量减小到75m3/ h.搅拌 为80r / min.以此来提高 C02的浓度；40h以后通气量和搅拌分别提高到110m3/ h和140r/min.以降低C02浓度使四环素产量提高 25%30%。C02形成的碳酸还可用碱来中和 但不能用CaC03罐压的调节也影响C02的浓度对菌体代谢和其他参数也产生影响。C02的产生与补料工艺控制密切相关 如在青霉素发酵中补糖会增加C02的浓度和降低 培养液的 pH 值

28、。因为补加的糖用于菌体生长、菌体维持和青霉素合成三方面 它们都产生C02使 C02量增加。溶解的C02和代谢产生的有机酸又使培养液pH值下降。因此补糖、 C02 pH值三者具有相关性被用于青霉素补料工艺的控制参数 其中排气中的C02量的变化 比pH值变化更为敏感所以采用测定CRR乍为控制补糖速率参数。第七节补料的控制补料分批发酵（fed-batchculture. 简称FBC）.又称半连续培养或半连续发酵 是指在 分批发酵过程中 间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法 是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式 是一种控制发酵的好方法 现已广泛用于发酵工业。同传统的分批发酵相比.

29、FBC具有以下的优点：可以解除底物抑制、产物反馈抑制和 分解代谢物的阻遏； 可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一 切影响改善发酵液流变学的性质；可用作为控制细胞质量的手段以提高发芽孢子的比例；可作为理论研究的手段 为自动控制和最优控制提供实验基础。同连续发酵相比.FBC不需要严格的无菌条件 产生菌也不会产生老化和变异等问题 适用范围也比连续发酵广泛。由于FBC有这些优点现已被广泛地用于微生物发酵生产和研究中。如已应用于酶类、 抗生素类、激素药物类、氨基酸和维生素等十余类几十种工业产品中。一、FBC的作用FBC的操作比较简单.效果也是比较明显的。但是这种控制方法是建立在什

30、么理论基础 上.对微生物的生理和产物的合成又能产生什么作用我们应该有个基本了解。已有研究结果表明.FBC对微生物发酵有下列几个基本作用。1.可以控制抑制性底物的浓度在许多发酵过程中 微生物的生长是受到基质浓度的影响。要想得到高密度的生物量需要投入几倍的基质。按monod方程当营养底物浓度增加到一定量时生长就显示饱和型动力学 再增加底物浓度 就可能产生一种基质抑制区 停滞期延长 菌体比生长速率减小 菌浓 下降等。 所以高浓度营养物对大多数微生物生长是不利的。 抑制微生物生长有多种原因： 有的基质过浓使渗透压过高细胞因脱水而死亡；高浓度基质能使微生物细胞热致死（themaldeath）.如乙醇浓度

31、达10%时就可使酵母细胞热致死； 有的是因某种或某些基质 对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用如高浓度苯酚（3 %5% ）可凝固蛋白；高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。在微生物发酵中 有的基质又是合成产物必需的前体物质 浓度过高 就会影响菌体代谢 或产生毒性 使产物产量降低。 如苯乙酸、 丙醇（或丙酸）分别是青霉素、 红霉素的前体物质 浓度过大 就会产生毒性 使抗生素产量减少。有的是受底物溶解度小的限制 达不到应有的 浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中 . 因它们的溶解度小 .使基质的浓度低 . 造成转化率 不高。为了在分批发酵中 . 获得高浓度菌体或产物 . 必须在基础培养基中防

32、止有过高浓度的基 质或抑制性底物采用FBC方式.就可以控制适当的基质浓度 解除其抑制作用又可得到高 浓度的产物。2可以解除或减弱分解代谢物的阻遏在微生物合成初级或次级代谢产物中 . 有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏 . 特别是葡萄糖 .它能够阻抑多种酶或产物的合成 .如纤维素酶、 赤霉素、青霉素等。 已知这种 阻遏作用不是葡萄糖的直接作用 . 而是由葡萄糖的分解代谢产物所引起的。通过补料来限制 基质葡萄糖的浓度 . 就可解除酶或其产物的阻遏 . 提高产物产量。如缓慢流加葡萄糖 . 纤维素 酶的产量几乎增加 200倍；将葡萄糖浓度控制在 0.02 %水平.赤霉素浓度可达905mg/ L;

33、采 用滴加葡萄糖的技术 .可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢 物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中 .也采用该技术来提高产量。3可以使发酵过程最佳化分批发酵动力学的研究阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术.就可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着FBC补料方式的不断改进为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用 . 已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的 数学模型在线方式实现最优化控制。二、补料的方式及控制补料方式有很多种情况 . 有连续流加、 不连续流加或多周期流加。 每次流加又可分为快 速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。从补

34、加培养基的成分来分. 又可分为单组分补料和多组分补料。流加操作控制系统又分为有反馈控制和无反馈控制两类。 这两类的数学模型在理论上没有什 么差别。 反馈控制系统是由传感器、 控制器和驱动器三个单元所组成。 根据控制依据的指标 不同 . 又分为直接方法和间接方法。间接方法是以溶氧、pH值、呼吸商、排气中C02分压及代谢产物浓度等作为控制参数。 对间接方法来说 . 选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标 . 是研究的关键。 这就需要详 尽考查分批发酵的代谢曲线和动力学特性 .获得各个参数之间的有意义的相互关系 .来确定 控制参数。对于通气发酵利用排气中C02含量作为FBC反馈控制参数是较为常用的

35、间接方 法。如控制青霉素生产所用的葡萄糖流加的质量平衡法就是利用C02的反馈控制。它是依靠精确测量C02的释放率CRR和葡萄糖的流动速度.达到控制菌体的比生长速率和菌浓。pH值也已用作糖的流加控制的参数。由于长期缺乏可靠的适时测定手段. 无法控制适时补料 . 所以直接法一直没有用于发酵控制。目前出现了各种类型生物传感器. 可供底物和产物的在线分析。但其应用仍然存在一些问题 （ 如耐热性差 ）. 尚待解决。 随着一系列技术障碍的克服 . 该法将会得到迅速普及。 反馈 控制的FBC.常常是依据个别指标来进行在许多情况下并不能奏效尚需进行多因子分析。为了改善发酵培养基的营养条件和去除部分发酵产物.F

36、BC 还可采用“放料和补料”（withdrawandfill） 方法.也就是说 .发酵一定时间 .产生了代谢产物后 .定时放出一部分发酵 液（可供提炼 ）. 同时补充一部分新鲜营养液 .并重复进行。 这样就可以维持一定的菌体生长速 率. 延长发酵产物生产期 . 有利于提高产物产量 . 又可降低成本。所以这也是另一个提高产量 的FBC方法但要注意染菌等问题。第八节泡沫对发酵的影响及其控制一、泡沫的形成及其对发酵的影响在大多数微生物发酵过程中 . 由于培养基中有蛋白类表面活性剂（具有较高的表面张 力）存在 .在通气条件下 .培养液中就形成了泡沫。 泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体 系 . 气液

37、之间被一层液膜隔开 . 彼此不相连通。 形成的泡沫有两种类型： 一种是发酵液液面上 的泡沫 . 气相所占的比例特别大 . 与液体有较明显的界限 . 如发酵前期的泡沫；另一种是发酵 液中的泡沫 .又称流态泡沫 （fluidfoam）. 分散在发酵液中 .比较稳定 .与液体之间无明显的界 限。发酵过程产生少量的泡沫是正常的。 泡沫的多少一方面与发酵罐搅拌、 通风有关； 另一 方面 .与培养基性质有关。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的发泡 剂。糊精含量多也引起泡沫的形成。发酵过程中 . 泡沫的形成有一定的规律性。发酵时起泡 的方式被认为有五种： 整个发酵过程中 .泡沫保持恒定的水

38、平； 发酵早期 . 起泡后稳定地 下降以后保持恒定；发酵前期泡沫稍微降低后又开始回升；发酵开始起泡能力低以后上升； 以上类型的综合方式。 这些方式的出现是与基质的种类、 通气搅拌强度和灭菌条 件等因素有关 . 其中基质中的有机氮源 （ 如黄豆饼粉等 ）是起泡的主要因素。当发酵感染杂菌 和噬菌体时 . 泡沫异常多。起泡会带来许多不利因素 . 如发酵罐的装料系数减少、液相体积氧传递系数减小等。泡 沫过多时 . 影响更为严重 . 造成大量逃液 . 发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等 . 严重时通气搅拌也无法进行 . 菌体呼吸受到阻碍 . 导致代谢异常或菌体自溶。所以 . 控制泡沫 乃是保证正

39、常发酵的基本条件。二、泡沫的消除泡沫的控制可以采用三种途径：调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次 投料）来控制 .以减少泡沫形成的机会。 但这些方法的效果有一定的限度； 采用机械消泡或 消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫；还可以采用菌种选育的方法筛选不产生流态泡沫的菌种 . 来消除起泡的内在因素 . 如用杂交方法选育出不产生流态泡沫的土霉素生产 菌株。对于已形成的泡沫 . 工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。1机械消泡这是一种物理消泡的方法 . 利用机械强烈振动或压力变化而使泡

40、沫破裂。有罐内消泡和 罐外消泡两种方法。前者是靠罐内消泡浆转动打碎泡沫；后者是将泡沫引到罐外. 通过喷嘴的加速作用或利用离心力来消除泡沫。该法的优点是：节省辅料.减少染菌机会。但消泡效果不理想 . 仅可作为消泡的辅助方法。2消泡剂消泡这是利用外界加入消泡剂 . 使泡沫破裂的方法。 消泡剂都是表面活性剂 . 具有较低的表面 张力 . 或者是降低泡沫液膜的机械强度 . 或者是降低液膜的表面黏度 . 或者兼有两者的作用 . 达到破裂泡沫的目的。 如聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）的表面张力仅为3.3 X 10-2N/m.而青霉 素发酵液的表面张力为 （6.06.8） X 10-2N/ m作为生物工业理想

41、的消泡剂 . 应具备下列条件： 应该在气 -液界面上具有足够大的铺展 系数.才能迅速发挥消泡作用。这就要求消泡剂有一定的亲水性；应该在低浓度时具有消 泡活性；应该具有持久的消泡或抑泡性能.以防止形成新的泡沫；应该对微生物、人类和动物无毒性； 应该对产物的提取不产生任何影响； 不会在使用、 运输中引起任何危害； 来源方便.成本低；应该对氧传递不产生影响；能耐高温灭菌。常用的消泡剂主要有天然油脂类 . 高碳醇、 脂肪酸和酯类 . 聚醚类及硅酮类等 4大类。 其 中以天然油酯类和聚醚类在生物发酵中最为常用。天然油脂类中有豆油、玉米油、棉籽油、 菜籽油和猪油等。 此类油不仅用作消泡剂 . 还可作为碳源

42、和发酵控制的手段 . 它们的消泡能力 和对产物合成的影响各不相同。 例如： 土霉素发酵 . 豆油、 玉米油较好 . 而亚麻油则会产生不良的作用。此类油的质量还会影响消泡效果 碘价（表示油分子结构中含有不饱和键的多少 ） 或酸价高的油脂消泡能力差并产生不良的影响。所以 要控制此类油的质量并要进行发酵 试验检验。此类油的新鲜程度也有影响 油越新鲜所含的天然抗氧化剂越多形成过氧化物 的机会少酸价也低消泡能力强副作用也小。植物油与铁离子接触能与氧形成过氧化物 对四环素、卡那霉素的合成不利 故要注意此类油的贮存保管。聚醚类消泡剂的品种很多。它们是氧化丙烯或氧化丙烯和环氧乙烷与甘油聚合而成的聚 合物。氧化

43、丙烯与甘油聚合而成的叫聚氧丙烯甘油（简称GP型）;氧化丙烯、环氧乙烷与甘 油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油 （简称GPE型）又称泡敌。它们的分子结构式如下：CH2OtQHOKHCH20（030）I1CHCKG%。）CH O（G&O 几一 （GTO 几 Hch2-o（ c3h6o）whch2-o（ c,出 o几一（G h#o人 h聚氧丙烯甘油聚氧乙烯氧丙烯甘油GP的亲水性差在发泡介质中的溶解度小所以用于稀薄发酵液中要比用于黏稠发酵 液中的效果好。其抑泡性能比消泡性能好适宜用于基础培养基中以抑制泡沫的产生。女口用 于链霉素的基础培养基中抑泡效果明显可全部代替食用油也未发现不良影响消泡效力

44、 一般相当于豆油的 6080倍。GPE的亲水性好在发泡介质中易铺展消泡能力强作用又快而溶解度相应也大所以 消泡活性维持时间短因此用于黏稠发酵液的效果比用于稀薄的好。GPE用于四环类抗生素发酵中消泡效果很好用量为0.03 %0.035 % 消泡能力一般相当于豆油的 1020倍。其他的消泡剂如：聚乙二醇等高碳醇消泡剂多适用于霉菌发酵 硅酮类较适用于微碱性 的细菌发酵。所以应结合具体产品发酵试验上述各种消泡剂的消泡效果 以获得良好的消 泡作用。消泡剂多数是溶解度小、 分散性不十分好的高（大）分子化合物所以在使用时要考虑如 何降低它的黏度和提高它的分散性来增强它们的消泡效果。使用的增效方法有：加载体增

45、效即用惰性载体（如矿物油、植物油等）使消泡剂溶解分散达到增效的目的；消泡剂并 用增效取各种消泡剂的优点进行互补 达到增效如GP和GPE以 1:1混合使用于土霉素发酵 结果比单独使用 GP的效力提高2倍；乳化消泡剂增效用乳化剂（或分散剂）将消泡剂制成 乳剂以提高分散能力增强消泡效力 一般只适用于亲水性差的消泡剂。如用吐温80制成的乳剂用于庆大霉素发酵效力提高12倍。在生产过程中消泡的效果除了与消泡剂种类、性质、分子量大小、消泡剂亲油亲水基 等密切关系外还和消泡剂使用时加入方法、使用浓度、温度等有很大的关系。消泡剂的选 择和实际使用还有许多问题 应结合生产实际加以注意和解决。第九节发酵终点的判断微

46、生物发酵终点的判断对提高产物的生产能力和经济效益是很重要的。生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。生产率=产物浓度 发酵时间式中生产率单位一般为 g/ （L h）或kg/ （m3 h）.产物浓度单位为g/ L或kg/ m3发酵时间单位为 h。生产过程不能只单纯追求高生产率. 而不顾及产品的成本 . 必须把二者结合起来 . 既要有高产量 . 又要降低成本。发酵过程中的产物形成 . 有的是随菌体的生长而生产 . 如初级代谢产物氨基酸等； 有的代 谢产物的产生与菌体生长无明显的关系 . 生长阶段不产生产物 . 直到稳定期 . 才进入产物生产 期. 如抗生素的合成

47、就是如此。 但是无论是初级代谢产物还是次级代谢产物发酵 . 到了衰亡期 菌体的产物分泌能力都要下降 . 产物的生产率相应下降或停止。 有的产生菌在衰亡期 . 营养耗 尽. 菌体衰老而进入自溶 . 释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。要确定一个合理的放罐时间 . 需要考虑下列几个因素：一、经济因素发酵时间需要考虑经济因素 .也就是 .要以最低的成本来获得最大生产率的时间为最适 发酵时间。 在实际生产中 .发酵周期缩短 .设备的利用率提高。 但在生产率较小 （或停止 ）的情 况下 .单位体积发酵液的产物产量增长就有限. 如果继续延长时间 .使平均生产率下降 .而动力消耗、 管理费用支出、 设备消

48、耗等费用仍在增加 . 因而产物成本增加。 所以. 需要从经济学 观点确定一个合理时间。二、产品质量因素发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大的影响。 如果发酵时间太短 . 势必有过多的 尚未代谢的营养物质 （ 如可溶性蛋白、脂肪等 ）残留在发酵液中。这些物质对下游操作提取、 分离等工序都不利。如果发酵时间太长 . 菌体会自溶 . 释放出菌体蛋白或体内的酶 . 又会显著 改变发酵液的性质 .增加过滤工序的难度 . 这不仅使过滤时间延长 .甚至使一些不稳定的产物 遭到破坏。所有这些影响 . 都可能使产物的质量下降 . 产物中杂质含量增加 . 故要考虑发酵周 期长短对提取工序的影响。三、特殊因素在个

49、别特殊发酵情况下 .还要考虑个别因素。 对老品种的发酵来说 . 放罐时间都已掌握 . 在正常情况下 . 可根据作业计划 .按时放罐。但在异常情况下 .如染菌、代谢异常 （糖耗缓慢等 ）. 就应根据不同情况 .进行适当处理。为了能够得到尽量多的产物 . 应该及时采取措施 （如改变 温度或补充营养等 ）. 并适当提前或拖后放罐时间。合理的放罐时间是由实验来确定的 . 即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵 罐的生产率和产品成本 . 采用生产率高而成本又低的时间 . 作为放罐时间。不同的发酵类型 . 要求达到的目标不同 . 因而对发酵终点的判断标准也应有所不同。 一般 对发酵和原材料成本占整个

50、生产成本主要部分的发酵产品 . 主要追求提高生产率、得率 （kg 产物/ kg基质）和发酵系数kg产物/ （罐容m3 发酵周期h）。下游技术成本占的比重较大、 产品价格较贵 .除了高的生产率和发酵系数外 .还要求高的产物浓度。 因此 .考虑放罐时间时 . 还应考虑总生产率 （放罐时产物浓度除以总发酵生产时间）。这里总发酵生产时间包括发酵周期和辅助操作时间 .因此要提高总生产率 . 则有必要缩短发酵周期 .这就是要在产物生成速率 较低时放罐。 延长发酵虽然略能提高产物浓度 .但生产率下降 .且耗电大 .成本提高 .每吨冷却 水所得到的产物产量下跌。另外.放罐时间对下游工序有很大影响。放罐过早.

51、会残留过多的养分 （如糖、脂肪、可溶性蛋白 ）对提取不利 （ 这些物质能增加乳化作用 .干扰树脂的交换 ）；放罐过晚 .菌体自溶 . 会延长过滤时间 . 还会使产物产量降低 （ 有些抗生素单位下跌 ）. 扰乱提取作业计划。 放罐临近 时. 加糖、 补料或消泡剂都要慎重 . 因残留物对提取有影响。 补料可根据糖耗速率计算到放罐 时允许的残留量来控制。一般判断放罐的主要指标有：产物浓度、氨基氮浓度、菌体形态、 pH 值、培养液的外观、黏度等确定。染菌罐一般过滤速度较慢。放罐时间可根据作业计划 进行.但在异常发酵时 .就应当机立断 .以免倒罐。 新品种发酵 . 更需摸索合理的放罐时间。 不同发酵产品

52、 . 发酵终点的判断指标略有出入。总之. 发酵终点的判断需综合多方面的因素统筹考虑。第十节发酵过程检测与自控发酵过程的基本任务是要对菌株所具有的内在生产能力实现高效表达 . 从而以较低的 能量和物料消耗生产更多的发酵产品。发酵动力学为这种表达提供了部分理论依据 . 但要在 实际发酵过程中实现 . 还必须解决一些工程学方面的问题 . 即发酵参数等的检测与自控问题。检测和自控技术在发酵工业中的应用相当晚. 但这种应用一经确立 . 就形成了迅速发展的势头 .并且在某种程度上超过了其他产业。 电子计算机的使用 . 为这一发展注入了巨大的活 力. 使发酵工业面临一场新的变革。然而. 由于发酵过程的反应异

53、常复杂 . 描述这一反应的数学模型尚欠完善 . 并且由于在线检测过程关键变量传感器的缺乏 . 使自控技术在发酵工业中 的应用目前仍受到很大的局限 . 需要各学科的专家共同作出进一步的努力。发酵过程检测是为了取得所给定发酵过程及其菌株的生理生化特征数据 . 以便对过程实 施有效的控制。 检测的具体目的包括： 了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符； 决定种子罐移种和发酵罐放罐的时间； 对不可测变量进行间接估计； 对过程变量按给定 值进行手动控制或自动控制；通过过程模型实施计算机控制；收集认识和发展过程（包括建立数学模型 ） 所必需的数据。检测的方法有物理测量 （ 如温度、压力、体积、流量等 ）

54、. 物理化学测量 （pH 值、溶 O2、 溶C02氧化还原电位、气相成分等 ）.化学测量（基质、前体、产物等的浓度）.以及生物学 和生物化学测量 （ 生物量、 细胞形态、 酶活性、 胞内成分等 ） 。这些测量可提供反映环境变化 和细胞代谢生理变化的许多重要信息 . 作为研究和控制发酵过程的基础。它们的测量原理简 述于表 7-2 中。表 7-2 发酵过程变量检测系统一、发酵过程对传感器的特殊要求为了适应自控的需要 . 发酵过程变量变化的信息 . 应尽可能通过安装在发酵罐内的传感 器检知 . 然后由变送器把非电信号转换为标准电信号 . 让仪表显示、 记录或传送给电子计算机 处理。用于发酵过程的传感

55、器 . 由于所面临的过程及其检测对象的特殊性 . 故除了满足常规要 求. 诸如：可靠性、准确性、精确度、响应时间、分辨能力、灵敏度、测量范围、特异性、 可维修性等 . 还应当满足一些特殊要求。 传感器与发酵液直接接触 . 因而首先面临一个灭菌问 题。一般要求传感器能与发酵液同时进行高压蒸汽灭菌 . 这对于大部分物理和物理化学传感 器来说都没有问题但有的（如pH值和溶氧）传感器在灭菌后需要重新校准。不能耐受蒸汽 灭菌的传感器可在罐外用其他方法灭菌后无菌装入。其次是在发酵过程中保持无菌的问题.这就要求与外界大气隔绝 . 采用的方法有蒸汽汽封、 “0”形环密封、套管隔断等。还有一个 问题是传感器易被培养基和细胞