抗体工程制药

1、 抗体工程制药抗体工程制药一.概述 抗体抗体( (工程工程) )制药制药生物技术制药生物技术制药领域的重要组成部分领域的重要组成部分抗体抗体：能与相应抗原特异性结合的具有能与相应抗原特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白免疫功能的球蛋白。抗体的产生过程：抗体的产生过程： 机体免疫系统受抗原机体免疫系统受抗原物质刺激后，物质刺激后，b b淋巴淋巴细胞细胞被激活，增殖和被激活，增殖和分化为浆细胞，由浆分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球细胞合成和分泌的球蛋白。蛋白。 免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)(immunoglobulin,ig)分子量范围分子量范围从从150,0001

2、50,000到到950,000950,000道尔顿。道尔顿。iggigg在血清中含量最高，达在血清中含量最高，达7575 80%,80%,是抗感染是抗感染 的主要抗体的主要抗体; ;igmigm是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为 五聚体五聚体, ,是对一个抗原作出反应时产生的是对一个抗原作出反应时产生的 ；igaiga在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参 与局部的免疫反应与局部的免疫反应; ;igdigd在血清中含量很低在血清中含量很低; ;igeige在血清含量最少。在血清含量最少。动物血清中产生抗体的时间示意图抗原刺激的第一

3、至三周，igm生成；抗原再刺激后， ig将取代igm抗体研究的发展阶段：抗体研究的发展阶段：以以18901890年年behringbehring发现发现为代表为代表, ,用用抗原免疫动物来获得抗原免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体。以以19751975年年milstein & kohlermilstein & kohler创建创建制备制备单克隆抗体单克隆抗体(mcab)(mcab)为代表。为代表。以以19941994年年winter,winter,创建了创建了噬菌体抗体库噬菌体抗体库(repertoire of antibodies displayed on (repertoi

4、re of antibodies displayed on phages)phages)技术技术, ,以基因工程方法制备抗体为代以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。表。在此基础上发展成抗体工程。多克隆抗体多克隆抗体: : 一种抗原一种抗原具有具有多个多个抗原决定簇抗原决定簇, ,每个每个抗原决定簇都能刺激抗原决定簇都能刺激b b细胞产生一种细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。体的混和物。单克隆抗体单克隆抗体( (monoclonal antibodymonoclonal antibody mcab): mcab): 由

5、由一个一个抗原决定簇抗原决定簇刺激的、刺激的、单一单一的的b b细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一高度均一的抗体。的抗体。1 234多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆抗体pure single abafter immunization, the mouse spleen contains b cells producing specific antibodies.each b cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. conven

6、tional antiserum is the mixture of all antibodies producedby b cells from spleen.if a single b cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. but b cell can not survive well in the culture.each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antib

7、ody.if b cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.adapted from milstein (1980) scientific american, oct. p.581234mmmm12341234monoclonalantibodiescell fusionspleen cells+myelomaxantiseumantigenimmunizationa mixture of all ab1 234balb/ c12341 234b cellpure sing

8、le abafter immunization, the mouse spleen contains b cells producing specific antibodies.each b cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. conventional antiserum is the mixture of all antibodies producedby b cells from spleen.if a single b cell was picked up and cu

9、ltured, then it will produce only one kind of antibody. but b cell can not survive well in the culture.each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.if b cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.adapted from milstein (1980)

10、scientific american, oct. p.581234mmmm12341234monoclonalantibodiescell fusionspleen cells+myelomaxantiseumantigenimmunizationa mixture of all ab1 234balb/ c12341 234b cell二二. 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备二二. .单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程图图解解单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程图图解解一一. .抗原与动物免疫抗原与动物免疫 1.1.抗原选择抗原选择 完整细胞完整细胞( (

11、肿瘤细胞肿瘤细胞) )；可溶；可溶 性蛋白质或多肽性蛋白质或多肽; ; 2. 2.免疫动物免疫动物 小鼠小鼠(balb/c,(balb/c,鼠龄鼠龄6-86-8周周) )或或 大鼠大鼠 (lou);(lou); 3.3.常用的骨髓瘤细胞系常用的骨髓瘤细胞系 sp2/0 sp2/0，p3.653p3.653细细 胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (hgprt)(hgprt)的缺乏株的缺乏株。4.4.免疫方法免疫方法: : 体外免疫法；体内免疫法体外免疫法；体内免疫法n体内免疫法体内免疫法 - - 颗粒性抗原颗粒性抗原( (如细菌、细胞如细菌、细胞) )的免

12、疫原性强的免疫原性强, ,可不加佐剂可不加佐剂, ,可溶性抗原则按每可溶性抗原则按每只小鼠只小鼠10-100ug10-100ug抗原与抗原与弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂等量混合等量混合后注入腹腔内后注入腹腔内. . 弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂（freundfreunds complete s complete adjuvant,fcaadjuvant,fca）: : 由矿物油（如降脂烷或液由矿物油（如降脂烷或液体石蜡等）、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的体石蜡等）、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的乳化佐剂。乳化佐剂。 弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂不含不含分枝杆菌分枝杆菌 免疫佐剂（adjuvant ) （1

13、）定义：先于抗原或同时与抗原混合注射机体 可增强抗原的免疫原性的物质。 （2）应用 弱免疫原性物质； 免疫原剂量不足。 （3）佐剂种类 1)油性乳剂弗氏佐剂弗氏佐剂（freund adjuvant） 2)无机化合物 3)微生物及其产物 4)脂质体 5)细胞因子二二. .细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 1.1.细胞融合的基本方法细胞融合的基本方法(peg(peg促融促融) ) 脾细胞脾细胞 骨髓骨髓瘤瘤细胞细胞( (“永久永久”细胞细胞) ) (1 (110108 8) (2) (2 3 310107 7) ) 聚乙二醇聚乙二醇(peg)(peg) 37-40

14、37-40 2mins 2mins 融合细胞融合细胞（杂交瘤细胞）（杂交瘤细胞） 用作细胞融合剂的聚乙二醇用作细胞融合剂的聚乙二醇(peg)(peg)一般选用一般选用mwmw40004000，常，常用浓度为用浓度为5050，ph8.0ph8.0ph8.2 ph8.2 。可加入二甲基亚砜可加入二甲基亚砜(dmso)(dmso)。 20022002年年1212月神舟月神舟4 4号飞船搭载号飞船搭载b b淋巴细胞淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验 原理：原理： 细胞进行融合时，培养液中只有部分细细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的

15、双亲胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中行选择。其中最常用的是最常用的是hathat选择系统选择系统。2 2、杂交瘤细胞的、杂交瘤细胞的选择性培养选择性培养n常用的选择培养基为常用的选择培养基为hathat培养基培养基。 次黄嘌呤次黄嘌呤(h)(h)、氨基喋呤、氨基喋呤( (a a

16、能阻断能阻断dnadna合成合成) )、 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(t)(t)。n脾细胞具有脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt)(hgprt), ,因此脾因此脾- -瘤融合的杂交瘤细胞可利用瘤融合的杂交瘤细胞可利用hgprthgprt酶酶, ,用次黄嘌呤用次黄嘌呤(h)(h)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶(t)(t)合成合成dna,dna,使杂交瘤细胞得以生长。使杂交瘤细胞得以生长。 hat选择培养机制 主要途径主要途径 糖糖氨基酸氨基酸 氨甲喋呤氨甲喋呤（a） 次黄嘌呤次黄嘌呤(h) gmp 核苷酸核苷酸 dna hgprt核苷酸前体核苷酸前体 tk(胸苷激酶)胸腺

17、嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(t) dtmphat培养基： h h 为次黄嘌呤，是hgprt的底物，为dna合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） a a 可阻断正常的dna合成（嘌呤及tmp合成受抑制） t t 在胸苷激酶（tk）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为dna合成提供原料n含有饲养细胞的含有饲养细胞的24/9624/96孔板内悬浮培养，孔板内悬浮培养，2 2 3 3天天换液一次换液一次(hat(hat的培养液的培养液7 7天内天内),),第第7 7 1414天天改改用用htht培养液（对照阻的骨髓瘤细胞已死亡）培养液（对照阻的骨髓瘤细胞已死亡）1414天以后天以后用普通的用普通的rpmi1640r

18、pmi1640完全培养液。完全培养液。n常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。胞和胸腺细胞等。n8 8 9 9天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测体检测, ,筛选出产生抗体的阳性克隆筛选出产生抗体的阳性克隆. .培培 养养 板板b b细胞杂交瘤的技术流程细胞杂交瘤的技术流程三三. .筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆与克隆化 1.1.筛选方法：筛选方法： 免疫酶技术免疫酶技术 放射免疫技术放射免疫技术 免疫荧光技术免疫荧光技术 （1）免疫酶技术n原理：将原理：将抗原和抗体抗原和抗体的免疫反应和的免疫反

19、应和酶的催化酶的催化反应反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，在相应而合适也不影响酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参与下，使的作用底物参与下，使基质水解而呈色基质水解而呈色，或，或使供氢体由使供氢体由无色的还原型无色的还原型变为变为有色的氧化型有色的氧化型，从而表明某种抗原或抗体的存在。从而表明某种抗原或抗体的存在。 （2）免疫荧光技术 原理：原理： 将将抗原抗体抗原抗体反应的特异性和敏感性与反应的特异性和敏感性与显微示显微示踪踪的精确性相结合

20、。以的精确性相结合。以荧光素荧光素作为标记物，作为标记物，与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测和鉴定抗原或抗体测和鉴定抗原或抗体。 免疫荧光技术免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测用于细胞抗原的抗体检测, ,特特别是检测患者活检组织标本。别是检测患者活检组织标本。（3）放射免疫技术n原理：将原理：将同位素同位素分析的高灵敏度与分析的高灵敏度与抗原抗原抗体抗体反应的特异性相结合，以反应的特异性相结合，以放射性同放射性同位素位素作为示踪物的标记免疫测定方法。作为示踪物的标记免疫测定方

21、法。n放射免疫测定原理示意图放射免疫测定原理示意图 2. 2.克隆化克隆化 为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性，为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性，将将单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。团的整个培养过程。 n有限稀释法有限稀释法：通过一系列稀释，使每个细胞：通过一系列稀释，使每个细胞培养孔平均培养孔平均只含一个细胞只含一个细胞，而分离细胞，而分离细胞n软琼脂法软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体将杂交瘤细胞悬液分散在半固体营养琼脂糖上，使呈营养琼脂糖上，使呈单个细胞单个细胞定位生长繁殖，定位生长繁殖，以达到克隆化的目的。以达到克隆化的目的。四四.

22、.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1. 1. 杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定 多数为端着丝粒染色体多数为端着丝粒染色体, ,染色体数目染色体数目 接近两种亲本细胞染色体之和。接近两种亲本细胞染色体之和。 2. 2. 抗体鉴定抗体鉴定 igig类和亚类鉴定：免疫扩散或类和亚类鉴定：免疫扩散或 elisaelisa法法 亲和力鉴定亲和力鉴定抗体类别鉴定（ig类和亚类鉴定） 抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其与抗原的作用不同，可分为不同的类和亚类。与抗原的作用不同，可分为不同的类和亚类。 iggigg（igg1ig

23、g1、igg2igg2、igg3igg3、igg4igg4） igaiga（iga1iga1、iga2iga2） igmigm（无）（无） igd igd （无）（无） ige ige （无）（无）1）免疫扩散n指可溶性抗原与相应抗体在指可溶性抗原与相应抗体在液相中液相中特异结合后，特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀线沉淀线现象。现象。 单向免疫扩散单向免疫扩散 双向免疫扩散双向免疫扩散 （2）酶联免疫吸附法(elisa)n原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步面

24、，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度酶催化产生的颜色及其吸光度(a)(a)值的大小进值的大小进行定性或定量分析的方法。行定性或定量分析的方法。 elisaelisa五五. .单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的工业化生产 单克隆抗体的生产包括细胞培养、单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。提纯和制剂等工艺过程。1.

25、1.杂交瘤细胞的大规模培养杂交瘤细胞的大规模培养n生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养 罐，微囊发酵罐罐，微囊发酵罐n培养基：牛淋巴液，血清培养基：牛淋巴液，血清2.2.单克隆抗体的大量制备的方法单克隆抗体的大量制备的方法n体外培养法体外培养法 ( (收获收获10-400ug/ml10-400ug/ml抗体抗体) ) 酶标板上培养酶标板上培养 微载体悬浮培养（固体颗粒用微载体悬浮培养（固体颗粒用deae-sephadex deae-sephadex a50a50等材料）。等材料）。n动物体内诱生法动物体内诱生法 用用0.5ml0.5ml降脂烷降脂烷/ /

26、液体石蜡液体石蜡注入腹腔注入腹腔, ,然后注射然后注射1 110106 6杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，再再 收获收获5 5 2omg/ml2omg/ml抗体。抗体。支原体污染！支原体污染！3.3.单克隆抗体单克隆抗体(mcab)的纯化的纯化纯化单克隆抗体流程纯化单克隆抗体流程( (大鼠大鼠) )单抗纯化方法单抗纯化方法: : 超滤法超滤法 盐析法盐析法 离子交换法离子交换法 凝胶过滤法凝胶过滤法 hplchplc法等法等三三. .单克隆抗体单克隆抗体药物的现状药物的现状n250250多种抗体类药物在临床试验中多种抗体类药物在临床试验中 1/31/3已进入三期临床已进入三期临床 1/41/4已通过临

27、床已通过临床iiiiii期试验期试验n美国市场上有美国市场上有1313种治疗用的抗体药物种治疗用的抗体药物n抗体药物的销售额抗体药物的销售额97-9997-99年由年由4.684.68亿美元增长到亿美元增长到1313亿美元亿美元0303年抗体类药物总销售额达到年抗体类药物总销售额达到5050亿美元亿美元抗体药物市场销售额抗体药物市场销售额0 0202040406060808010010012012014014016016020022002 20032003 20042004 20052005 20062006 20072007 20082008年份年份销售额（亿美元）销售额（亿美元）2011全

28、球有超过全球有超过200200家上市或未上市公司正在研发家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司（正在进行临床试验的抗体公司（38家）：家）：abgenixalexion pharmaltarexapplied molecular evolutionbasfbiogenbiotransplantcat(cambridge ab tech)celltechcenteoncentocor (johnson & johnson) elanelsaieli lillygenzyme transgenicsgenentec

29、hgenmabhoffman-la rocheicos pharmidec pharm/mitsubishiimclone sysimmunotechkaneboknoll pharmleukositemedarexmedimmunenorvartisortho biotechpasteur-merieuxprogenicsprotein design labscheringsmithkline beechamtanox biosystemstechniclonexomazenyaku当前美国治疗性抗体市场当前美国治疗性抗体市场nreopro (j&j, centocor,lilly)

30、reopro (j&j, centocor,lilly)1994/1994/$461 m$461 mabciximab,abciximab,鼠鼠 抗抗gpiib/iigpiib/ii抗体抗体, ,防止血小板凝集防止血小板凝集凝血性心血管疾病凝血性心血管疾病 - ami, - ami, 不稳定型心绞痛不稳定型心绞痛nrituxan (idec/genentech/roche)rituxan (idec/genentech/roche)1997/1997/$303 m$303 mrituximab, rituximab, 嵌合嵌合 抗抗cd20cd20抗体抗体非霍奇金氏淋巴瘤非霍奇金氏淋巴

31、瘤nherceptin (genentech)herceptin (genentech)1998/1998/$204 m$204 mtrastuzumabtrastuzumab人源化人源化 抗抗her-2/neuher-2/neu抗体抗体her-2 her-2 过量表达乳腺癌过量表达乳腺癌nsynagis (medimmune)synagis (medimmune)1998/1998/$285 m$285 mpalivizumabpalivizumab 人源化人源化 抗抗-rsv f -rsv f 糖蛋白抗体糖蛋白抗体 小儿小儿rsvrsv感染感染当前美国治疗性抗体市场当前美国治疗性抗体市场n

32、remicade (centocor)1998 $130 minfliximab 嵌合嵌合 抗抗tnf-抗体抗体局限性肠炎，类风湿关节炎局限性肠炎，类风湿关节炎nzenapax (pdl, roche)1997 $130 mdacliximab,人源化人源化, 抗抗tac (il-2 receptor )抗体抗体移植排斥移植排斥northoclone okt3 (ortho biotech) 1998 $60 mmuromonab 鼠鼠 抗抗cd-3 (t cells)抗体抗体移植排斥移植排斥nsimulect (novartis)1998 $54 mbasiliximab 嵌合嵌合 抗抗cd

33、25 (il-2 receptor) 抗体抗体移植排斥移植排斥n抗体类型抗体类型鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体orthoclonorthoclone e器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗体嵌合抗体peopropeopro冠状动脉成形术，心绞痛冠状动脉成形术，心绞痛嵌合抗体嵌合抗体rituxanrituxanb b细胞型非霍奇金淋巴瘤细胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗体嵌合抗体simulectsimulect器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗体嵌合抗体remicaderemicade回肠炎，类风湿性关节炎回肠炎，类风湿性关节炎人源化抗体人源化抗体zenapaxzenapax器官移植排斥器官移植排斥人源化抗体人源化

34、抗体synagissynagis婴儿呼吸道合胞病毒婴儿呼吸道合胞病毒人源化抗体人源化抗体herceptiherceptin n乳腺癌乳腺癌人源化抗体人源化抗体campathcampath慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病人源化抗体偶联物人源化抗体偶联物mylotargmylotarg急性复发骨髓白血病急性复发骨髓白血病鼠源抗体放射性偶联物鼠源抗体放射性偶联物zevalinzevalinb b细胞型非霍奇金淋巴瘤细胞型非霍奇金淋巴瘤中国抗体研究现状中国抗体研究现状单抗诊断剂：单抗诊断剂：针对乙型肝炎表面抗原针对乙型肝炎表面抗原流行性出血热流行性出血热抗人抗人t t淋巴细胞及亚群淋巴细胞及亚群风

35、疹病毒风疹病毒黑热病黑热病抗人绒毛膜促性腺激素抗人绒毛膜促性腺激素霍乱霍乱抗人白细胞相关抗原抗人白细胞相关抗原抗人免疫球蛋白的系列抗人免疫球蛋白的系列脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒登革热登革热99mtc99mtc肺癌单抗片段诊断剂进肺癌单抗片段诊断剂进入入i i期临床。期临床。单抗治疗剂：单抗治疗剂：碘碘131i-131i-肝癌单抗片段肝癌单抗片段注射液，注射液，20102010年已完成年已完成v v期临床期临床 成为低毒、安成为低毒、安全、有效的全、有效的肝癌靶向治疗肝癌靶向治疗药物药物。 华神利卡汀华神利卡汀2.88w /2.88w /支支乙脑单抗治疗剂进入乙脑单

36、抗治疗剂进入、和和期期临床试验，临床试验，肾综合症出血热单抗进入肾综合症出血热单抗进入、和和期临床。期临床。中国中国人源基因工程抗体人源基因工程抗体研究获重大研究获重大成果成果 中国预防医科院病毒所青年科学家中国预防医科院病毒所青年科学家梁米芳梁米芳研研究员率领的课题组，在究员率领的课题组，在“治疗用人源基因工程抗治疗用人源基因工程抗体基础与应用研究体基础与应用研究”中取得多项重要成果。在中取得多项重要成果。在世世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒犬病毒人源基因工程抗体人源基因工程抗体，并获得拥有自主知识，并获得拥有自主知识产权的全抗体表

37、达载体系统。产权的全抗体表达载体系统。 与血源制品比较，此抗体具有抗体含量高、与血源制品比较，此抗体具有抗体含量高、无免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，无免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，是一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物是一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物。此成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途此成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途经，具有良好的应用开发前景。经，具有良好的应用开发前景。 -2004原液保存原液保存 细菌疫苗细菌疫苗工艺流程示意图工艺流程示意图菌种筛选菌种筛选种子批的种子批的建立及检定建立及检定菌种接种菌种接种原液合并原液合并半成品半成品

38、 配置配置杀菌杀菌原液收获原液收获扩大培养扩大培养分装分装包装包装检定检定中国疫苗研究：中国疫苗研究：病毒原病毒原液保存液保存 病毒疫苗病毒疫苗工艺流程工艺流程毒种筛选毒种筛选种子批的种子批的建立及检定建立及检定 毒种接种毒种接种#培养细胞培养细胞原液合并原液合并 半成品半成品 配置配置病毒灭活病毒灭活病毒的收病毒的收获过滤获过滤扩大细扩大细胞培养胞培养分装分装包装包装检定检定 原代细胞的原代细胞的 制备或传代制备或传代细胞复苏细胞复苏减毒活疫苗减毒活疫苗抗体的治疗应用抗体的治疗应用n抗肿瘤抗肿瘤n抗感染抗感染n抗器官移植排斥反应抗器官移植排斥反应n治疗自身免疫性疾病和变态反治疗自身免疫性疾病

39、和变态反应性疾病应性疾病抗体药物迅速发展的主要障碍抗体药物迅速发展的主要障碍n人体免疫系统对鼠人体免疫系统对鼠源蛋白的排斥反应源蛋白的排斥反应n抗体抗体人源化人源化是解决是解决问题的唯一途径问题的唯一途径四四. .单克隆抗体人源化的改进单克隆抗体人源化的改进n鼠抗体人源化（人鼠抗体人源化（人- -鼠嵌合、改型抗体）鼠嵌合、改型抗体）n小分子抗体（小分子抗体（fabfab、单链、单域、超变区多肽）、单链、单域、超变区多肽）n基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）n人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）n人人- -

40、人抗体人抗体 人鼠嵌合抗体构建过程：人鼠嵌合抗体构建过程：人抗鼠抗体反应(hama)抗体类型抗体类型鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体orthoclonorthoclone e器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗体嵌合抗体peopropeopro冠状动脉成形术，心绞痛冠状动脉成形术，心绞痛嵌合抗体嵌合抗体rituxanrituxanb b细胞型非霍奇金淋巴瘤细胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗体嵌合抗体simulectsimulect器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗体嵌合抗体remicaderemicade回肠炎，类风湿性关节炎回肠炎，类风湿性关节炎人源化抗体人源化抗体zenapaxzenapax器官移植排斥器官移植

41、排斥人源化抗体人源化抗体synagissynagis婴儿呼吸道合胞病毒婴儿呼吸道合胞病毒人源化抗体人源化抗体herceptiherceptin n乳腺癌乳腺癌人源化抗体人源化抗体campathcampath慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病人源化抗体人源化抗体偶联物偶联物mylotargmylotarg急性复发骨髓白血病急性复发骨髓白血病鼠源抗体放射性偶联物鼠源抗体放射性偶联物zevalinzevalinb b细胞型非霍奇金淋巴瘤细胞型非霍奇金淋巴瘤 (3)单域抗体(4)最小识别单位 噬菌体抗体噬菌体抗体 用用scidscid小鼠制备人单抗小鼠制备人单抗scidscid小鼠小鼠移植入人淋巴细

42、胞移植入人淋巴细胞 （人鼠嵌合模型）（人鼠嵌合模型）抗原免疫抗原免疫杂交瘤技术杂交瘤技术基因工程基因工程人单抗人单抗人抗体鼠人抗体鼠将小鼠将小鼠igig基因灭活，然基因灭活，然后转入人后转入人igig基因，生产出人单抗基因，生产出人单抗遗传工程鼠遗传工程鼠基因工程抗体真核细胞高效表达流程图基因工程抗体真核细胞高效表达流程图单抗研发的演变历程单抗研发的演变历程鼠单抗鼠单抗100% 鼠源鼠源okt-3panorexzevalin鼠鼠/人崁合单抗人崁合单抗(66-75 % 人源人源)reopro, rituxanremicadesimulect人源化单抗人源化单抗(90-95 % 人源人源)zena

43、pax, mylotarg, herceptin, campathsynagis100% 人源人源 抗体在体外人源化存在的问题抗体在体外人源化存在的问题n操作过程复杂操作过程复杂n需付出昂贵的代价需付出昂贵的代价n抗体的亲和力降低抗体的亲和力降低n抗体不是人体免疫系统天然产生抗体不是人体免疫系统天然产生n异源抗体与免疫系统的配合异源抗体与免疫系统的配合最理想的单克隆抗体最理想的单克隆抗体n100%100%人源人源n人类免疫系统自然产人类免疫系统自然产生生全人抗体的理论基础全人抗体的理论基础n癌症细胞、病毒、细菌对人机体而言均为癌症细胞、病毒、细菌对人机体而言均为异己物异己物n人体不断受异己物攻

44、击，但免疫系统通常人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有清除能力有清除能力n免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应物做出反应n体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体全人抗体面临的关键问题全人抗体面临的关键问题n持续分泌抗体的人持续分泌抗体的人 b b细胞细胞n抗体分泌细胞的保持抗体分泌细胞的保持3030年来的全人抗体的尝试年来的全人抗体的尝试n鼠骨髓瘤不适合与人鼠骨髓瘤不适合与人b b细胞融合细胞融合 - -稳定性差稳定性差 - -抗体产量低抗体产量低 n非洲淋巴细胞瘤病毒非洲淋巴细胞瘤病毒 (ebv) (ebv)

45、保存抗体分保存抗体分泌细胞泌细胞 - -细胞株不稳定细胞株不稳定 - -抗体的产量低抗体的产量低 - -不能特异性地保存抗体分泌细胞不能特异性地保存抗体分泌细胞n很难获得人类骨髓瘤细胞株很难获得人类骨髓瘤细胞株全人抗体技术的最新突破全人抗体技术的最新突破 成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体的研究进成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体的研究进入新的里程入新的里程n用途：能稳定的保持人用途：能稳定的保持人b b细胞分泌抗体的能力细胞分泌抗体的能力n发明人：英国剑桥大学的发明人：英国剑桥大学的dr.karpasdr.karpas教授教授n意义：意义： 1 1 在整体水平上研究人类产生的抗体在整体水平上研究

46、人类产生的抗体 2 2 开创人类抗体基因组学的研究开创人类抗体基因组学的研究n评价：评价： 诺贝尔奖得主诺贝尔奖得主dr.milstein dr.milstein 推荐发表推荐发表 在在pnaspnas，世界权威杂志，世界权威杂志“科学科学”发表发表了了 新闻评述，剑桥大学开了新闻发布会新闻评述，剑桥大学开了新闻发布会人人杂交瘤技术人人杂交瘤技术n开发针对未知抗原的全人治疗用抗开发针对未知抗原的全人治疗用抗体的唯一技术体的唯一技术n分离、保存稳定分泌天然抗体的分离、保存稳定分泌天然抗体的b b细细胞先进方法。胞先进方法。n寻找新型肿瘤相关抗原的捷径寻找新型肿瘤相关抗原的捷径人人杂交瘤技术的优势

47、人人杂交瘤技术的优势（1 1）迅速高效的生产天然人类单克隆抗体）迅速高效的生产天然人类单克隆抗体 抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成，抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成， 不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合良好良好 能获得最佳亲和力和中和活性的抗体能获得最佳亲和力和中和活性的抗体 更合理的自然选择药物设计方式更合理的自然选择药物设计方式 加速抗原的发现和抗体的开发过程加速抗原的发现和抗体的开发过程人人杂交瘤技术的优势人人杂交瘤技术的优势 （2 2）简便、低费用的抗原抗体研究生产方式）简便、低费用的抗原抗体研究生产方式与其他抗体改良技术相比操作更简便与其他抗体改良技术相比操作更简便起始抗体分泌水平较高，可直接用于工起始抗体分泌水平较高，