Southern印迹杂交实验报告

1、southern印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号业：公共卫生实验时间：12.18； 12.25带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作 【实验原理】将待检测的dna分了川或不川限制性内切酶消化p，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离， 继而将其变性并按其在凝胶屮的位h转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素 或-k它标记物标记的dna或rna探针进行反庖，检测靶dna片段屮是否存在与探针同源的 序列。如果待检物中含冇与探针互补的序列，则二者通过碱锥互补的原理进行结介，游离探 针洗涤后用a.w.影或其它合适的技术进行检测，从而敁示!11待检的片段及其相对大小

2、。 用途：检测样品巾的dna及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩增重排等。 【实验步骤】1、基因组dna的限制性內切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列s依次加入菽因组dna、10x酶缓冲液，酶，做好标记。老师给 的 hl60 基因组 dnaloug （7.6u l）; loxbuffer e （10.4u l）； ecor i （iou/pl） （2ul）。总 体积20 u lo 37'c保温1.5小吋。2、1 °%琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2gagarose放入三角烧瓶屮，加入60mltae溶液，微波炉屮加热令 完全溶解，稍作冷却后加入gelred核酸染液6u

3、l （稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待 凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。 基因组dna10 20ui （自己的） 基因组dna10 ug （老师的） 酶切样品 阳性对照（c-myc4.7 kb线性片段，30pg/p 1,10 u i） 酶切样品 基因组dna10 pg （老师的） 基因组dna10 20ui （&己的）插上电源，负极在样品槽一边，dna将向阳极跑，80v电泳2小吋左右，直到溴酚蓝染料跑 到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。3、变性切胶，26孔，宽4.5cm,长7cm（从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺） 将凝胶浸在5倍体积的

4、胶变性液中，慢慢摇动20分钟。 ddh20洗2次。 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。4、转移 在搪瓷盘中加入300 mll0xssc,放上培养皿和小玻璃板。 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔而卜），赶走滤纸与胶之m的气泡。 再将与胶人小相同的尼龙膜（沒湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸浞的 滤纸，赶走气泡。 紧贴凝胶网周各放一张x光片。 小心蒙上一张比搪瓷盘人的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，佴不能让滤纸移动。 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。収走滤纸上的 保鲜膜。 整齐地放上草纸

5、，数张草纸-折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10 cm。 在草纸上放上玻璃板，压上约500 g重的重物，转移过夜。5、罔定 将胶和尼龙膜一起翻过來，川铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。 正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。6、杂交和洗膜将尼龙膜放入杂交管内，加预杂交液，68"c封w 6小吋。倒出预杂交液，加杂交液，68°c 杂交过夜。i叫收杂交液（可重复使用），将脱放在洗脱溶液i （2xssc,0.1%sds）屮，室温洗 2次，每次摇动5分钟。再在洗膜溶液ii （0.5xssc, 0.1%sds）中,68°c洗2次，每次摇动15 分钟。7、检测 将膜在缓冲液1（

6、马來酸缓冲液屮漂洗3分钟。 在缓冲液2 （封闭液）中室温摇动封闭30分钟。 在含anti-dig-ap的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 用洗胶溶液iii （马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次，每次15分钟。 在缓冲液3 （检测缓冲液）中平衡3分钟。 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中溫育0.5-16小时。 当条带显色到合适的深度或在脱背景变深前，用te或ddh2o洗去底物液，拍照井干 燥保存。【实验结果】上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和southern blot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显 示1-3条带（基因组dna自己的；基因组dna老师的；酶切样品）均有dna什段显示，4 阳性对照

7、对应条带无dna八段显示，1、2条带因为菽因组很大，在电场作用下基本不会动， 故在靠近加样孔的地方；而酶切厂；的基因组由于断裂成一系列的片段，电泳时会形成均匀的 涂抹状，见条带3:尾巴高亮怀疑是rna量过多；southern blot只显示了阳性对照结果。 【注意事项】1、dna限制性酶的用量l-5u/ugdna，时间为1-20小时。中途可取少量（小于十分之一） 电泳检测足否酶切完全。2、edta会抑制酶活性，迕酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。3、内切酶一般保存在u*油中，u*油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体 积的十分之一，否则应将反应体积加人。4、荇基因组d

8、na浓度低，可在酶切后用一冲成点浓缩dna后跑胶。5、标记探针在加入杂交液之前，一定要加热变性处理，并.r.要先在杂交液中混匀p加入， 不要直接加在膜上。6、杂交也可以在杂交袋中进行。7、含有dig标记探针的杂交液可以放在-20" c保存，反复多次使用,每次用前在68° c热 变性。8、为了获得最佳效果，第一次使用的探针，可做系列模拟杂交，即将小块尼龙膜在不同探 针浓度的杂交液中杂交过夜，然p经显色检测，采川背景可以接受的高的探针浓度进行真 实杂交。9、第一次杂交的dna可用碱去除探针（限于尼龙膜），用第二个探针做预杂交和杂交。10、杂交的灵敏度取决于杂交液中探针的弄得和显

9、色时间。11、对子尼龙膜可釆用碱溶液转移，更有利于dna的结合。12、若目的片段大于10kb可用0.25mol/ihci先部分脱嘌呤，使片段变短，便于有效转移。【讨论】 结果分析木实验凝胶电泳p，紫外灯下观察1-3条带均冇dna八段显示，4阳性对照对应条带无 dna片段显示。转膜结果中只有阳性对照组有杂交后显色，可能原因有：本实验采川毛细管法向上转 移，可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全，使dna含量非常少，以至于无法 抗-dig-碱性磷酸酶及k酶底物显色；dna含:w:过少，非放射性你记探针法灵敏度不高， 可以试川放射性探针标记法提岛灵敏度:预杂交液封闭非特异性结合位点吋也结合了含

10、景 很低的待测dna位点，可以尝试用不m浓度的预杂交液来封闭非特昇性位点；洗膜条件 有：低严格度（低温、高盐）、高严格度（高温、低盐），随着盐浓度增加,杂交率增加（na+ 的作川），尚浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以洗膜吋一定要按照低严格度一尚严 格度，可以减少dna的流失。 影响杂交的因素：1、待检核酸分子的浓度和长度，浓度越大，s性速度越快，敏感性越高；分子越大，转膜 越困难，敏感性下降。2、探针的性质（标记效率、浓度，核酸性质）：对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；探 针标记方法和检测方法的选择。进行探针标记的标记物分两大类：放射性和非放射性。放射性标记物的乂敏度极岛，可 检测到1

11、0-1410-18g的物质，在最适条件下，可检测出样品屮少于1000个分子的核酸含 量，但是存在着放射性污染及放射核素发牛衰变所产牛.的不稳定性两大缺点。非放射性标记 物（生物素、地高辛、荧光物质、酶类、金属hg等）优点是无放射性污染，稳定性好，可 以较长时间存放等。木实验采用地高辛连接于dutp上进行标记，地高辛标记的探针与靶核酸杂交后，用带 有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行免疫结合反应，通过酶底物的化学显色来显示。与放射性 标记和比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针 讨以松期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰， 敏感性商。3、杂交液体积、温度和杂交吋间：体积越小，杂交动力学越高；dna/dna杂交适宜的复性 温度为比tm低2025°c;温度i非特昇性t ;温度t敏感性i。4、杂交液的离了强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率増加（na+的作 川），尚浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的杂交吋，必须维持 杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。5、非特异性杂交反应：预杂交的作用，杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异吸附。常用的封闭物：变性非特异dna：鮭负