稻曲病病原菌毒素探究进展

1、稻曲病病原菌毒素探究进展摘要：水稻稻曲病是由稻曲病病原菌(ustilaginoidea virens (cooke) tak.)引起的水稻穗部真菌病害。稻曲病 病原菌次生代谢产生稻曲病病原菌毒素(ustiloxins),该 毒素是一类具有阻断真核细胞有丝分裂活性的环肽毒素，有 较强的细胞毒活性，对人畜和植物有毒害作用，也是一种具 有潜在应用前景的抗肿瘤药物。对稻曲病病原菌毒素的理化 性质、毒性特点、获取方式、检测手段的研究进展进行了简 要综述，并初步展望了稻曲病病原菌毒素的研究前景。关键词：稻曲病病原菌(ustilaginoidea virens (cooke) tak.);稻曲病病原菌毒素；

2、提取和纯化；检测；人工合成 中图分类号：s435. 111.4+6文献标识码：a文章编号： 0439-8114 (2012) 21-4701-04research progress on ustilaginoidea virensfan yun-qingl, zhang shu2a, yu da_zhao2a，gong yan2b(1.college of food science and technology ,huazhong agricultural university， wuhan 430070 , china；2a. hubei key laboratory of crop dis

3、eases, insect pests and weeds control； 2b. institute of agricultural quality standards & testing technology, hubei academy of agricultural sciences, wuhan 430064， china)abstract： rice false smut is a common rice fungousdisease caused by ustilagionidea virens. as secondary metabolism of u. virens

4、, ustiloxins are cyclopepetide mycotoxins , and exhibit phytotoxic and mycotoxic effects through their potent microtubule disassembly and inhibition of mitosis. ustiloxins also pose potential applications as the antitumor agents. the chemistry ， obtaining manners ， isolation and purification, detect

5、ion and artificial synthesis of ustiloxins were reviewed briefly, and the developing trends were also proposed.key words： ustilaginoidea virens (cooke) tak.； ustiloxins； isolation and purification； detection； artificial synthesis水稻稻曲病是一种世界性水稻真菌病害1，主要病症 为水稻穗部产生稻曲球。自20世纪70年代以来，由于水稻 品种的变化、耕作制度的改变和化学肥料的

6、大量使用，以及 杂交水稻的问世等因素，稻曲病的发生及危害呈加重趋势， 已成为中国及世界上许多稻区的主要病害之一。19331937 年，yabuta等首先从稻曲球的乙醚提取物分离到一种色素， 称之为ustilaginoidins。中国植物病理学家学家朱凤美在20世纪50年代指出稻曲病含一类c9h607的有毒色素。邓根 生2经研究发现此毒素是一种生物碱。到现在为止，已经 发现稻曲病病原菌(ustilaginoidea virens (cooke) tak.) 的次生代谢产物有两类，第一类为绿核菌素 (ustilaginoidins),属于萘并咄喃酮1类，为脂溶性有色物 质；另一类为稻曲病病原菌毒素

7、(ustiloxins)，又称黑粉 菌素，属于环肽类，为水溶性无色物质。学者们普遍认为稻 曲病病原菌毒素是由稻曲病病原菌厚垣孢子产生的。这两类 次生代谢产物均具有较强的细胞毒活性。稻曲病病原菌毒素一方面对植物和人畜产生毒性，与稻 谷及其制品的食用安全有着密切的关系；另一方面可抑制癌 细胞的有丝分裂，是一种具有潜在应用前景的抗肿瘤药物。 下面对稻曲病病原菌毒素的理化性质、毒性、获取方式、检 测手段、人工合成以及研究展望等方面进行简要综述。1稻曲病病原菌毒素的理化性质到目前为止，研究人员已从稻曲球中分离到6种毒素， 分另1j是 ustiloxin a，ustiloxin b, ustiloxin

8、c, ustiloxin d, ustiloxin e, ustiloxin f,其结构式如图 1 所示。 ustiloxin e较为罕见，分离量太少而无法做试验，目前其 结构式和分子式尚不清楚3。稻曲病病原菌毒素最具代表 性、含量最多的是ustiloxin a，分子式为c28h43n5012s， 精确质量数为673.262 9，为无色针晶、高极性和不挥发的化合物，茚三酮反应呈紫色，最大吸收波长为207、249和 287 nm，在正离子模式下可生成加氢离子m+h+。2稻曲病病原菌毒素的毒害作用2. 1对动物的毒害作用稻曲病病原菌毒素对动物细胞有广泛的生物活性。如 nakamura等4报道了其对

9、老鼠的毒性主要是引起老鼠心 脏、肾脏病变。高峻5报道，稻曲病粒对鸡和兔有一定的 毒性，混用病粒喂养的鸡和兔都会出现慢性中毒症状，其心 脏、肝脏和肺部发生病变，直至死亡。伍永炎6报道，患 病动物会出现腹泻、下痢、流涎、呕吐、呼吸急促、中枢神 经兴奋或麻痹，头部及四肢肌肉痉挛，渴感增加等症状。家 畜体温升高到40. 541. 5 °c，腹痛磨牙、四肢刨地、拱背、 肚腹卷缩、伏卧四肢伸直。病理解剖可见胃肠黏膜有出血性 炎症，肺部和脾脏出血，肝脏肿大，淋巴结充血水肿，心外 膜及心内膜多有出血，胸腹腔有较多的透明黄色液体，泌尿系统有出血性炎症，脑膜或脑皮质出血 的毒害作用2.2对植物稻曲病病原

10、菌毒素溶液对水稻种子萌发、幼苗生长及愈 伤组织生长都具有毒害作用，且与品种田间的感病性和抗病 性相一致7;稻曲病病原菌培养滤液稀释40倍后对小麦胚 根的生长有强烈的抑制作用，其对小麦胚根的抑制作用明显 高于对胚芽的抑制作用8;将稻曲病病原菌毒素稀释100 倍后对水稻种子萌发仍有强烈的抑制作用9;稻曲球水浸 提液对玉米胚芽和胚根的生长也具有明显的抑制作用10。2.3细胞毒活性koi so 等11用 ustiloxin a 和 ustiloxin b 对人的胃、 肺、心脏、结肠和肾的癌细胞系进行侵染试验，发现其对各 种癌细胞系都有抑制作用。后续研究发现ustiloxin a和 ustiloxin

11、b对癌细胞的作用与5-氟尿定相同。ustiloxin a对胃癌(mkn-1)和乳癌(mcf-7)细胞的ic50分别为2. 460和 0. 656 pg/muustiloxinb 对胃癌 mkn-l、mkn-7、mkn-74、 肺癌 rerf-lc-ma、乳癌 mcf-7、肠癌 widr、sw480 和胃癌 ku2 株呈细胞毒活性，其ic50依次为3. 22、4.91、5.19、5.60、 0.86、4.68、6. 08 和 4. 43 umol/l12o morisaki 等13 测得的 ustiloxin a、ustiloxin b、ustiloxin c、ustiloxin d、ustil

12、oxin f对微管蛋白组装的中等有效抑制浓度分别为 1.0、1.8、4.4、2.5、10.3 umol/l。稻曲病病原菌毒素通 过抑制真核生物微管蛋白的组装与细胞骨架形成，从而起到 抑制细胞有丝分裂的作用，其活性部位是稻曲病病原菌毒素 的ch、nh官能团、酚羟基、c2和c6位烷基以及甘氨酸残基 的羧酸基团13-15。2.4白色菌株的毒性王疏等16分离获得1株不同于普通稻曲病病原菌的白 化菌株。白元俊等17对普通菌株和白化菌株的产毒能力进 行了比较研究，发现两种菌株均能产生抑制水稻种子萌发和 胚根、胚芽生长的毒素。白色菌株的产毒能力强于普通菌株， 在相同浓度下白色菌株毒素的毒性明显高于普通菌株。

13、3稻曲病病原菌毒素的获得3.1从病原体中获得3.1.1稻曲病病原菌的分离稻曲球营养丰富，易与杂 菌共生，加之该菌生长缓慢，分离难度大。目前，稻曲病病 原菌的分离主要有4种方法：即组织块分离法18、菌核分 离法19、稻曲球分离法20和厚垣孢子悬浮液法21。其 中组织块分离法成功率较高，是常用的分离方法。3.1.2产孢最适条件程明渊等22在对比了不同培养 基、不同营养条件（碳源和氮源）、不同ph、不同温度和光 照及不同代数的菌株产孢能力后，初步明确psa及大米培养 基是较为适宜的产孢培养基；23代菌株最易产孢；nh4c1 和kno3对厚垣抱子产生有一定的促进作用；产抱的适宜温 度为1525

14、76;c;培养基适宜的ph是57，ph 6为最佳； 光照对厚垣孢子的产生数量及时间都有很大的影响，明暗交 替是较为适宜的培养条件。周永力等18研究发现，稻曲病 病原菌在psa、pda两种液体培养基和燕麦片液体培养基中 以燕麦片最利于厚垣孢子的产生。王疏等9的研究表明， 菌株差异性对于产孢有根本性的影响。本课题组在前人研究的基础上对稻曲病病原菌产孢最 适条件进行了初步探索，并首次选取湿度作为条件之一进行 了试验。稻曲病病原菌产孢最适条件与程明渊等22报道的 结果基本一致，相对湿度80%为最佳湿度条件。3.1.3毒素粗提取以室内培养的稻曲病病原菌菌丝为 原材料，毒素提取方法可按照叶建仁等23的甲醇

15、提取法和 陈美军等8的硫酸铵沉淀法进行。其原材料采用的均是培 养20 d的菌丝，用纱布滤去菌丝得到培养滤液；毒素粗提 取不同在于前者取培养滤液100 ml，60 1水浴蒸干水分， 加入100 ml甲醇，振荡2h，充分萃取后离心去除甲醇不溶 物，上清液于60 °c水浴锅中水浴蒸干水分，再加入100 ml 去离子水悬浮溶解，得到粗毒素液；后者取滤液100 ml，加 a 43. 6 g固体硫酸铵溶解，用25%浓氨水调节ph至6. 5， 静置过夜后离心(6 000 r/min) 10 min,上清液即为稻曲 病病原菌毒素粗提取液。以稻曲球为原材料提取粗毒素的方法可按照王疏等9 的索氏提取方法

16、进行。称取100 g干燥的稻曲球，研碎后装 入索氏提取器中，加入的甲醇-水(9 : 1，v/v)回流10 h 左右，得到墨绿色溶液，加活性碳脱色，离心(4 000 r/min) 10 min得到淡黄色上清液，将上清液在30 °c水浴锅中水浴 12 d。最后得到淡黄色黏稠状物，即为稻曲病病原菌粗毒 素。也可参照miyazaki等24的方法，称取24 g稻曲球， 加入240 ml水浸提，取45 ml上清液经过甲醇和水活化的c18固相萃取柱（10g/35cc，美国waters公司），用looml 水洗柱，最后用100 ml 20%的甲醇溶液洗脱，洗脱液即为稻 曲病病原菌粗提物。3.1.4稻

17、曲病病原菌毒素的分离纯化稻曲病病原菌毒 素的分离纯化参照koiso等3的方法进行：取稻曲球的去 离子水浸提液，或取稻曲病病原菌培养液滤液，用反相硅胶 层析柱进行粗分，再反复进行反相硅胶和大孔吸附树脂 （diaion chp 20p）柱层析，可分别获得 ustiloxin a、b、 c、d 和 fo本实验室采取硅胶薄层色谱纯化稻曲病病原菌毒素，具 体方法如下：取稻曲球，用水在室温下浸泡1 h，浓缩，用 0ds-ss-1020t （200 g，senshu scientific co, ltd, tokyo, japan）色谱柱和20%的甲醇分离纯化，此时50 g稻曲球可 得到377 mg浅黄褐色

18、粉末（u-3）。u-3在硅胶薄层色谱tlc, 用正丁醇：甲醇：水（3:1:1，v/v/v）为展开剂，分离ustiloxin a这两种方法对ustiloxin a的收益均是500 g稻曲球获得约10 mg纯品。3.2稻曲病病原菌毒素的人工合成 在6种稻曲病病原菌毒素中，ustiloxin d的人工合成技术最为完善。据cao等25的报道，ustiloxin d的人工 合成由现成的d-丝氨酸和芳基氟，材料来完成，为了构造稻曲 病病原菌毒素特殊的手性烷基芳基醚支链，主反应中会涉及 一个芳香族亲核被取代；通过sharpless不对称氨基酸羟化 反应来实现羟基酪氨酸基团的形成，以及酪氨酸基团和 内酯基团的

19、特定选择性甲基化。ustiloxin a和b的人工合成技术也有进展，早在1997 年，hutton等26报道了合成具有立体选择性的ustiloxin a和b中间体(2s, 4s, 6s) -4-氢氧化物-5-苯亚磺酰戊氨 酸的方法。以钛作为催化剂，将n-boc- (s)-丙烯基甘氨酸 进行立体选择性的溴代内酯化，之后与硫苯酚反应将溴元素 置换为硫。这种具有高度立体选择性的硫化物氧化后成为亚 砜类，再经过内酯开环以及除去boc组分的操作即可得到中 间体。2005年，luke等14报道了利用埃文斯氏salen-al 来催化巯基异香蓝素衍生物的醇醛缩合反应，产物与戊氨酸 组结合，再通过不对称氧化反应

20、形成亚砜类，从而为化学合 成ustiloxin a的多巴-亚横酰戊氨酸结构开辟了道路。ustiloxins人工合成法的成熟有利于人们更深入地了 解其对有丝分裂有强效抑制作用的天然物质，有利于其同系 物和同型物的合成，以便大量使用。4稻曲病病原菌毒素的检测在稻曲病病原菌毒素粗提液中以ustiloxin a含量最 高，约为80%,因此稻曲病病原菌毒素的检测分析主要针对 的是ustiloxin a,可采用免疫测定的方法检测。因 ustiloxin a分子量较小，不能直接用作效价检测的抗原，须将ustiloxin a与载体蛋白如卵清蛋白（0a）偶联后才能 作检测抗血清效价的抗原。经elisa测定效价表

21、明，用戊二 醛作为偶联剂较好，且该抗血清效价已迗到了免疫学检测的 基本要求。为了研究抗体的特异性，陈美军等8做了进一 步的免疫胶体金标记分析，结果表明所制备的抗体能与毒素 特异性结合。仪器检测可采用miyazaki等24的高效液相色谱法， hplc条件为：wakosil-ii 5c18 rs柱，流动相为水-甲醇_ 磷酸（400 : 100 : 1，v/v/v）,流速为 0.5 ml/rain,二极管 阵列检测器，紫外检测波长为254 nm。本课题组另摸索出超 高效液相色谱-串联三重四极杆质谱方法，uplc条件为： waters uplc beh c18 柱（id 2. 1 mmxloo mm）

22、；流动相 a 为5 mmol/l甲酸铵/甲酸（ph 4.0），流动相b为甲醇，流 动相配比是90%a和10%b,等度洗脱；流速0.25 ml/min, 进样体积为5 pl。该超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱 方法检测所需的时间（6.36 min）是miyazaki等24所述 的hplc方法的50%左右。5研究展望国内外对稻曲病病原菌毒素的研究处于初步阶段，多集 中在对动植物毒性、化学合成、检测分析等方面，还存在很 多问题值得进一步探讨，如稻曲病病原菌毒素的产生机理； 稻曲病病原菌的生长与毒素产生、释放之间的关系问题；稻曲病病原菌毒素的降解机理；稻曲病病原菌毒素进入机体的动力学机制；稻曲病病原

23、菌毒素快速检测技术研究，稻曲病 病原菌毒素引起的食品安全风险预警及评估等。目前已证实ustiloxin a和b是强有力的抗有丝分裂剂， 对人体乳腺癌和肺癌细胞的抑制非常有效。如何将其变害为 宝，化害为利，也将成为稻曲病病原菌毒素的另一个重要的 研究方向。参考文献：1 ou s h. rice diseasem. london: common wealthmycological institute, 1972.288-295.2 邓根生.国内稻曲病研究现状j.植物保护， 1989， 15 (6)： 39-40.3 kosio y, morisaki n, yamashita y, et al.

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