酶的提取与分离纯化(2)ppt课件

1、第三章第三章 酶的提取与分别纯化酶的提取与分别纯化 电泳电泳electrophoresis, EPelectrophoresis, EP ：指：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向挪动的过程。相反的电极方向挪动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进展分别的实中迁移速度的不同而对物质进展分别的实验技术。验技术。第四节第四节 电电 泳泳一、电泳的根本实际一、电泳的根本实际 1. 1. 原理原理: : 在一定在一定pH条件下用条件下用buffer，不同大小、，不同大小、外形及带电颗粒在电

2、场中的挪动速度不同用迁外形及带电颗粒在电场中的挪动速度不同用迁移率表示，各自集中到特定的位置上而构成严移率表示，各自集中到特定的位置上而构成严密的泳动带。密的泳动带。 +- 影响迁移率的要素：影响迁移率的要素： 颗粒性质：颗粒性质：Q越大、越大、r越小、外形越接近球形，越小、外形越接近球形，v 越快。越快。 电场强度：电场强度：E越高，越高，v越快。越快。 电泳液：电泳液： pH值：离值：离pI越远，越远，v越快。用越快。用buffer坚持坚持恒定恒定 离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v 越低。越低。 通常，缓冲液离子强度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之之间。间。 电

3、电 渗：在电场中，液体对于固体支持物渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对挪动。的相对挪动。 应防止用高电渗物质作支持介质。应防止用高电渗物质作支持介质。 自在界面电泳：又称挪动界面电泳，自在界面电泳：又称挪动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进展的电指在没有支持介质的溶液中进展的电泳。泳。 区带电泳区带电泳: :指有支持介质的电泳，待指有支持介质的电泳，待分别物质在支持介质上分别成假设干分别物质在支持介质上分别成假设干区带。区带。 支持介质的作用支持介质的作用: :防止电泳过程防止电泳过程中的对流和分散。中的对流和分散。2. 2. 电泳的分类电泳的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按

4、支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保管照相，比纸电泳分辨率高。优点是简便迅速，便于保管照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分别物的电荷多少进展分别。应，主要靠被分别物的电荷多少进展分别。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 普通用于核酸的分别分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，

5、对普通用于核酸的分别分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只需很小的分子筛效应。大部分蛋白质只需很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于核酸和蛋白质的分别、纯化及检测。分辨率高。用于核酸和蛋白质的分别、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。 3. 电泳常用设备 1电泳仪 ：提供稳定直流电源的安装 。 常压电泳仪600V 高压电泳仪3000V 超高压电泳仪30000V50000V2电泳槽： 自在界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽3附属设备： 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！

6、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。的一种电泳方法。 1.1.原理原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体体AcrAcr和交联剂和交联剂N N，N N- -甲叉双丙烯甲叉双丙烯酰胺酰胺BisBis在催化剂和加速剂作用下在催化剂和加速剂作用下聚合的。聚合的。CH2=CHCH2=CHC=OC=ONH2NH2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH2 CH2 NH NH C=O C=O CH2=CH CH

7、2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH2 NH NH2 NH CH2 CH2 NH NH C=O C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 NH NH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N- -甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1化学催化系统：化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵催化剂：过硫酸

8、铵ammonium persulfate，AP 加速剂：加速剂：TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺 2光催化系统：核黄素光光催化系统：核黄素光TEMED 催化剂催化剂: 核黄素维生素核黄素维生素B2 引发剂引发剂: 光光 TEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。 . 凝胶浓度越大小，孔径越小大，凝胶浓度越大小，孔径越小大，可分别分子量较小大的颗粒。可分别分子量较小大的颗粒。 Acr与与Bis的分量比应在的分量比应在30左右。左右。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系样品样品分子量分子量DaDa适宜的凝胶浓度适宜的凝胶浓度蛋白质蛋白质104

9、551051052020303015152020101015155 510102 25 5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2. 2. 分别效应分别效应 PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：延续电泳延续电泳 采用一样孔径的凝胶和一样的缓冲采用一样孔径的凝胶和一样的缓冲系统系统不延续电泳不延续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系系 电荷效应电荷效应不延续不延续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 延续延续PAGEPAGE 电荷效应电荷效应:分别胶中，蛋白质外表净电分别胶中，蛋白质外表净电荷不同，迁

10、移率不同。荷不同，迁移率不同。 分子筛效应：大小和外形不同的样品分分子筛效应：大小和外形不同的样品分子经过一定孔径的分别胶时，受阻滞的程子经过一定孔径的分别胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。度不同而表现出不同的迁移率。 浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分别胶进展分别。一条窄带，然后再进入分别胶进展分别。不延续聚丙烯酰胺凝胶电泳不延续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不延续性表如今以下几个方面：系统的不延续性表如今以下几个方面： 1.1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分别

11、胶。小孔径的分别胶。 2.2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpH不同。电极缓冲液为不同。电极缓冲液为pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲液，分别胶为冲液，分别胶为pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。 3.3.在电场中构成不延续的电位梯度。在电场中构成不延续的电位梯度。 不延续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，不延续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。凝胶的分子筛效应和电

12、荷效应，提高了分辨率。三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳sodium dodecyl sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGEelectrophoresis, SDS- PAGE简简称称SDSSDSPAGEPAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的方法量的一种最好的方法 。1.1.原理：原理：SDSSDS是种阴离

13、子去污剂，带有大是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超越了天然蛋白质原有的带负电荷大大超越了天然蛋白质原有的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别。白质间原有电荷的差别。 SDS SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键翻开，引起蛋白质构象改乙醇使二硫键翻开，引起蛋白质构象改动，使蛋白质动，使蛋白质SDSSDS复合物外形近似椭圆复合物外形近似椭圆形，短轴一样形，短轴一样1.8nm1.8nm，长轴与蛋白质，长轴与蛋白质分子量成正比。分子量成正比。

14、 因此，蛋白质因此，蛋白质SDSSDS复合物在凝胶中复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和外形的的迁移率不受蛋白质原有电荷和外形的影响，只与椭圆棒长度蛋白质分子量影响，只与椭圆棒长度蛋白质分子量有关。有关。2. 2. 操作：操作：SDS-PAGESDS-PAGE及及PAGEPAGE，即变性及，即变性及非变性非变性 1 1制胶制胶: : 变性：变性：buffer buffer 中加中加0.4%SDS0.4%SDS a.a.分别胶：根据待分别样品的分子大分别胶：根据待分别样品的分子大小选择一定浓度的分别胶查表，小选择一定浓度的分别胶查表，配制分别胶溶液：配制分别胶溶液： Acr:Bis=29:

15、1Acr:Bis=29:1，分别胶，分别胶buffer, buffer, TEMED, AP, TEMED, AP, 水水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h0.5h聚合完全。聚合完全。 b.b.浓缩胶：用浓缩胶浓缩胶：用浓缩胶bufferbuffer。插上梳。插上梳子。子。2 2样品制备：样品制备： a.PAGE: a.PAGE: 样品样品缓冲液蔗糖或甘油指样品样品缓冲液蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝示剂溴酚蓝 b.SDS-PAGE: b.SDS-PAGE: 样品样品缓冲液样品样品缓冲液SDSSDS，甘油，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝，煮沸巯基乙醇，溴酚蓝，煮沸2-5mi

16、n2-5min， 以除去亚稳以除去亚稳态聚合。态聚合。3 3加样及电泳：加样及电泳： SDS-PAGE: SDS-PAGE: 电极电极bufferbuffer中加中加0.1%SDS0.1%SDS，溴酚蓝，溴酚蓝距下端距下端1cm1cm时停顿电泳。时停顿电泳。4 4固定及染色固定及染色a.a.固定：将凝胶浸于固定：将凝胶浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙酸中三氯乙酸中固定蛋白质组分。固定蛋白质组分。b.b.染色：染色： 考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 银染法灵敏度比前者高银染法灵敏度比前者高100100倍倍 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过

17、碘酸SchiffSchiff试剂糖蛋白。试剂糖蛋白。四、等电聚焦电泳四、等电聚焦电泳 ( isoelectric focusing，IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中参与载体两性电解质商品在其中参与载体两性电解质商品名：名：Ampholine，一种含有各种延续，一种含有各种延续 pI 的小分子混合物的电泳方法称的小分子混合物的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳IEF-PAGE。自学自学第五节第五节 酶的浓缩、枯燥与结晶酶的浓缩、枯燥与结晶一、酶的浓缩一、酶的浓缩 1 1 蒸发

18、浓缩蒸发浓缩 图图 4-60 4-60 减压蒸发浓缩的简易安装减压蒸发浓缩的简易安装 1 1蒸馏瓶蒸馏瓶 2 2毛细管毛细管 3 3螺旋夹螺旋夹 4 4橡皮管橡皮管 5 5温度计温度计 6 6出水口出水口 7 7冷凝器冷凝器 8 8进水口进水口 9 9衔接纳衔接纳 1010抽气口抽气口 1111接纳瓶接纳瓶2 2 超滤浓缩超滤浓缩 超滤浓缩以压力超滤浓缩以压力差为动力，将待浓差为动力，将待浓缩溶液经过超滤膜，缩溶液经过超滤膜，酶分子较大被滞留，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选水分子和小分子选择性透过，到达浓择性透过，到达浓缩目的缩目的 。图图4-61 酶的超滤浓缩酶的超滤浓缩 3 3 吸水剂

19、吸水剂 胶过滤浓缩胶过滤浓缩 利用葡聚糖凝胶利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50等的吸水特性。将干胶直接参与等的吸水特性。将干胶直接参与样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。心分出浓缩的酶液。聚乙二醇浓缩：聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇聚乙二醇polyethylene glycolpolyethylene glycol，简称，简称PEG PEG 。 利用利用PEGPEG的吸水特性。将的吸水特性。将PEGPEG涂于装有酶溶液涂于装有酶溶液的透析袋上，置于的透析袋上，置于44下，干下，干PEGPEG粉末吸收水和

20、盐粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。类，酶溶液即被浓缩。 普通用分子量大的普通用分子量大的PEG,PEG,如如PEG 6,000PEG 6,000和和PEG PEG 20,00020,000，以防止，以防止PEGPEG进入蛋白质溶液。进入蛋白质溶液。4 4 反复冻融浓缩反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分别。的原理使酶分子与小分子物质分别。 5 5 沉淀法沉淀法 盐析法，有机溶剂法盐析法，有机溶剂法二、酶的枯燥二、酶的枯燥 酶的枯燥多采用冷冻枯燥法。酶的枯燥多采用冷冻枯燥法。 将酶溶液在较低温度下将酶溶液在较低温度下-10-10到到

21、-50-50冻结成固态，然后在高度真空冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华枯燥。气态而除去，也称酶的升华枯燥。三、酶的结晶三、酶的结晶 结晶结晶CrystallizationCrystallization是指物质以晶体的形状从蒸汽或溶液是指物质以晶体的形状从蒸汽或溶液中析出的过程。中析出的过程。 结晶的条件结晶的条件 酶的纯度酶的纯度: :纯度越高越易结晶纯度越高越易结晶 50 50 2.2.酶的浓度酶的浓度 恰到益处恰到益处: : 浓度越高越易结晶，控制在饱和区以浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介

22、稳区内。上，过饱和区以下的介稳区内。3. 3. 结晶温度结晶温度 4. 4. 溶液溶液pHpH5. 5. 离子强度离子强度 6. 6. 晶核晶核 7. 7. 结晶时间结晶时间 第五节第五节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计 1 纯化方法的选择根据纯化方法的选择根据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差别根据有效成分和杂质之间理化性质的差别 调理溶解度：沉淀法调理溶解度：沉淀法 根据分子大小、外形的不同：根据分子大小、外形的不同： 离心分别，膜分别，凝胶过滤离心分别，膜分别，凝胶过滤 根据分子电荷性质的不同：离子交根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，

23、电泳换层析，电泳 根据专注性结合的方法：亲和层析根据专注性结合的方法：亲和层析 其它：吸附层析，疏水层析其它：吸附层析，疏水层析2 2 纯化方法的排序纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于减少样先选用粗放、快速、有利于减少样品体积的方法。准确、费时、需样品少品体积的方法。准确、费时、需样品少的方法，宜后选用。的方法，宜后选用。 二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价1 1 酶活力测定：酶活力测定： 酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)又称酶又称酶活性，即单位时间内酶促反响的产物活性，即单位时间内酶促反响的产物生成量生成量. . 是酶催化某一化学反响的

24、才干。是酶催化某一化学反响的才干。 方法：方法： 在酶反响开场后不同时间，从反在酶反响开场后不同时间，从反响系统中取出一定量反响液，用响系统中取出一定量反响液，用适当方法停顿其反响后，再根据适当方法停顿其反响后，再根据产物和底物在物化性质上的差别产物和底物在物化性质上的差别进展分析，求得单位时间的酶促进展分析，求得单位时间的酶促反响变化量。反响变化量。 常用的方法常用的方法 ： 化学分析法比色法：产物可与化学分析法比色法：产物可与特定的化学试剂反响生成稳定的有色溶特定的化学试剂反响生成稳定的有色溶液液 。 分光光度法分光光度法: :利用底物和产物光吸收利用底物和产物光吸收性质的不同性质的不同

25、。 量气法量气法: :酶促反响中产物或底物之一酶促反响中产物或底物之一为气体。为气体。 滴定法滴定法pHpH值丈量法：产物之一值丈量法：产物之一是自在的酸性物质或碱性物质。多用是自在的酸性物质或碱性物质。多用pHpH电电极测。极测。 常用终止反响方法：常用终止反响方法： 改动反响最适条件：改动反响最适条件： 加酸、碱、加热加酸、碱、加热 加酶变性剂：加酶变性剂： 5三氯乙酸三氯乙酸 酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。单位。 在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只需到达可比较的目的即可，如直接以光密单位，只需到达可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。度值表示。 2 2 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在环有共轭双键，在A280A280有最大吸收。特点：