EdU体外标记人脂肪干细胞实验探究

1、edu体外标记人脂肪干细胞实验探究摘要目的:体外培养人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, adscs)并行edu标记，并通过测试标记率及 标记后对细胞增殖分化的影响确定优化的标记时间及浓度 组合。方法：使用分别采5um, 10um, 20 nm, 50 um的浓 度及12h, 24h进行标记标记adsc,并以流式细胞仪精确测 定标记率。挑选出各12h及24h时优化标记浓度，并进行标 记后测定细胞活性，增殖及诱导分化实验。结果：p3代细胞 约90%以上表达表面标记cd90+, cd105+, cd44+。基本不表 达细胞表面标记cd45+, cd35+o通过各试验

2、，得出最适浓度 组合10um, 12h,对进一步研究脂肪干细胞在辅助脂肪移植 中的作用具有指导意义。结论：edu是标记方法简单有效， 体外最佳标记浓度组合是10 pm, 12ho关键词脂肪干细胞；细胞治疗；edu；干细胞标记； 细胞不踪中图分类号r622 q813. 1 文献标识码a 文章编 号1008-6455 (2013) 01-0043-05experimental study on the effect of labeling adipose derived stem cells with eduzhang yi, wang ke-ming, li fa-cheng, wang shu

3、-jie, li tai-ying, liuxin-hai, liu mei-chen, zhao xiao-hui,ma ji-guang(special medical department , plastic surgery hospital , chinese academy of medical sciences and peking union medical college, beijing 100144, china) abstract： objectives to est ablish the best met hod and optimal concentrantion a

4、nd optimal time for labeling adsc withthymidineanalog ,5-ethynyl-2-deoxyuridine ( edu ) methods adsc a/t passage 2 4 were labeled with edu by diverse concentration (5 u m, 10 u m, 20 u m, 50 u m) and diverse time (12h, 24h) . after labeled, the cell were stained by alexa-555 analyzed by fluorescence

5、 microscopy and flow cytometer. the impact of edu on the growth of adscs was examined by trypan blue exclusion, methylthiazoly tetrazoli u m ( mtt ) assay and assess multipie differentiation potential of adsc using in vitro osteogenic and adipogenic induetion. results labeling with edu in vitro can

6、be easily performed, and labeling stem cells with the concentration of 10 p m with 12h is the optimal concentration and time. the optimal concentration and time of labeling has little impact on the grow th of adsc or on the differe ntiation and can therefore be used for adsc trading conclusion the l

7、ebeling method with edu is simple but efficacious, and the optimal group is labeling with the concentration of 10 y m and the time with 12h.key words : adipose-derived stem cells ； cell therapy； edu； stem cell labeling； cell tracing人脂肪干细胞是存在于脂肪组织中的间充质干细胞，具 有多向分化的潜能。脂肪干细胞来源广泛且易获取，在临床 上吸脂手术后废弃的脂肪数量巨大，

8、使用酶可以将脂肪干细 胞分离出来1-2 o脂肪干细胞应用广泛，其促血管化能力 强及具有内分泌功能的优点可使其广泛用于细胞治疗、基因 治疗、组织工程等，现已应用于临床前期体内移植实验 3-4 o为进一步研究干细胞移植后的疗效及其原理，对干 细胞行有效的标记就显得尤为重要：通过示踪的方法，可以 直观得了解移植细胞在体内存活、迁移、分布、增殖、分化、 转归，得到疗效的评价及机制的推论。可以用来标记脂肪干 细胞的标记物有跟多种，各有优缺点6-7 o本实验中探讨 的标记物edu为新一代标记物，本质为核酸类似物，在细胞 分裂增殖的过程中参与到核染色体中达到标记目的8-9。 本实验以edu标记脂肪干细胞，使

9、用流氏细胞仪精准检测其 标记效率及对标记后细胞行增殖分化能力的测定以获得优 化标记条件。1材料和方法1. 1主要试剂及药品：低糖dmem培养基（葡萄糖 1000mg/l,谷氨駄胺4mm/l, hyclone公司，美国），特级胎 牛血清（fbs, gibico公司，美国），0. 25%胰蛋白酶（hyclone 公司，美国），平衡盐溶液（磷酸盐缓冲液， phosphat ebuf f er so 1 ut i on, pbs, hyclone 公司，美国），青 霉素-链霉素溶液（ps,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml, amresco公司，美国），i型胶原酶（sigma公司美国）二 甲

10、基亚矶（dmso, amresco公司，美国），mtt （sigma公司， 美国），鼠抗人单克隆抗体cd45, cd90, cd105, cd44, cd34 （购自 ebioscience 公司）edu （invitrogen 公司 美国）， 油红0,茜素红（sigma）。 1.2adscs分离培养和传代: 人脂肪抽吸术中应用10ml注射器接2. 0mm吸脂针，无菌状 态下将脂肪组织离心，去上层脂肪组织，加入终浓度为 0. 075%的i型胶原酶。37工恒温箱，震荡消化40mino收集 最下层细胞沉淀。1ml完全培养基重悬细胞。加入3ml红细 胞裂解液并轻轻漩涡颠倒均匀，置于冰上15min,其

11、间轻轻 漩涡均匀混悬两次。并将其置于直径为6cm的中皿内。将培 养皿置入体积分数为5%c02、饱和湿度371培养。待细胞贴 壁后更换培养液，去掉非贴壁细胞，更换新培养液。以后每 3天更换细胞培养液1次。每日在相差倒置显微镜下观察细 胞形态及生长情况。原代细胞培养7天即可融合传代。1.3流式细胞仪检测细胞表型：取第3代adsc制成单 细胞悬液，进行分装并行抗体标记，每份不少于1x106细 胞。室温下以 cd45-fitc. cd90-fitc. cd105-fitc、cd44-pe、 cd34-pe抗体标记，igg-fitc, igg-pe为同型对照，不标记 细胞为空白对照。入流式细胞仪检测细胞

12、表面标记物。1.4 edu标记及染色：使用第3代细胞作为实验细胞。 在细胞状态良好时加入edu并孵育至合适时间，去除edu, pbs洗净背景。对于固定细胞的染色及检测：使用96孔板以edu标记 细胞后固定染色。含3.7%甲醛的pbs固定。并以含0. 5% tritonr x-100的pbs破膜，加入染色反应液click-itr, 避光、室温、脱色摇床孵育30mino其中取各实验组混合细 胞作为对照不染alexa-555染料。除去染色反应液后，加入 背景核染料hoechst,避光、室温、脱色摇床孵育30mino pbs清洗3次，4£保存。荧光显微镜观察。对于单细胞悬液的染色及检测：将标

13、记后细胞收集起来 并制成单细胞悬液。取未标记edu细胞作为阴性对照，并取 各实验组混合细胞作为对照，不染alexa-555染料。通过流 式细胞仪检测表达率反应edu在adsc的标记率。1. 5测定edu对adsc活性及影响其增殖及分化的程度: 根据实验结果，分别选择在12h, 24h时优化标记浓度即 10um, 12h； 5um, 24ho进行细胞活性及增殖分化检测。以oum, oh作为空白对照，分别行台盼蓝排斥实验，mtt比 色实验和成脂成骨定向分化实验对细胞活性进行测定。定向 诱导分化完成后行茜素红染色及油红0染色观察。染色后以 倒置显微镜观察钙结节及脂滴生成情况，100倍视野下，分 别随

14、即选取5个高倍视野进行计算，计算钙结节及脂滴的个 数。多组间比较采用重复测量资料的方差分析，标记率最高 组与其余组比较采用dunnett-1检验进行统计学分析，统计 软件采用spss 20.0分析，p0. 05,无统计学差异。5nm, 24h标记组与另两组p<0. 05,有统计学差异（图10、12）o综合以上实验结果，推断使用edu标记人脂肪干细胞时，以10 um的浓度标记12h为优化的标记方式。3讨论3. 1 edu （5-乙烘基-2'脱氧尿11 密唳核昔）是一种胸腺 喀唳核昔类似物10,其连有的烘坯基团在自然化合物中很 少见，能够在dna复制s期时代替胸腺“密噪（t）渗入正在

15、 合成的dna分子中，最早合成被用作核昔类似物类抗菌药物 11-13,近年来，越来越多的被用来检测dna复制及细胞 增殖。edu参与增殖时插入到正在复制的dna分子中，可被 显色剂与edu发生共辄反应而检测新合成的dna14-15。与 传统的免疫荧光染色（brdu）检测方法相比，更为方便且对 细胞影响小16-17 o所以，本实验预通过对edu标记adsc 的研究，探求优化标记浓度及标记时间，成为示踪剂追踪移 植入体内的adsc,观察其转归。3. 2 edu是核标记物，相当于探针在细胞分裂时参与dna 的合成而进入细胞14-15 o标记整个细胞的过程与细胞增 殖活性有关，而染色率与细胞活性有关，

16、活性高者细胞分裂 增殖快，相同时间内染色率高，活性低者或细胞量多进入平 台期者细胞分裂增殖慢，相同时间内染色率低18-19 o故 选取状态优良且为对数期的细胞进行标记。标记时间选取细 胞倍增时间，浓度则需要多次尝试。过高的浓度或过长的时 间将导致状态不良的细胞死亡。3. 3 edu标记方法的探讨：理想的细胞标记物除标记率 高外，需对细胞的增殖分化也无影响。虽然edu分子量小， 对细胞影响较小，但高浓度或长时间标记会影响细胞的代谢 及增殖分化。edu是新一代细胞核标记物，用dmso或去离子 水溶解为储存液时，二者的标记性质发生了改变，以dmso 溶解者，染料标记细胞核时扩散作用明显，可以提高细胞

17、标 记率。但dmso将影响细胞的增殖分化及体内过程。而以去 离子水溶解者，染色后对细胞活性影响较小，但是影响其标 记率，需要通过增加标记时间或浓度提高标记率20 o标记时，将传代的细胞孵育过夜后再行细胞标记，配置 2倍浓度的edu待用，去除一半培养基后将2倍浓度的培养 基加入培养皿中孵育。使细胞保持局部微环境使其影响变 小。也有助于edu在培养基中混合均匀。一些细胞在标记后形态有所改变，细胞变宽，变大，核 染色较深。其原因可能与有机溶剂dmso有关，dmso是在低 温冻存下细胞穿透性的保护剂，常温下有机溶剂具有细胞毒 作用。随标记浓度的增加，细胞形态改变也逐渐明显，甚至 细胞死亡数量增加，在这

18、些可能与dmso浓度增加有关。这 也与国外报道的dmso具有细胞毒作用，且浓度及时间依赖 性相一致。3. 4 edu对细胞损害原因探讨：在流式细胞检测过程中, 相同细胞量细胞经过不同浓度的edu染色相同时间后从培养 皿上消化下来制成单细胞悬液进行检测，可发现细胞量有变 化，浓度高者细胞量少，证明经染色后细胞有部分死亡现象。 其死亡率与染色浓度成正比。分析其原因可能为：染料对 细胞的毒性作用；有机溶剂对细胞的毒性作用；因培养 皿上细胞的浓度不同，使细胞消化，离心的操作对细胞的损 耗不一。3. 5对adsc的讨论：edu标记的原理是作为核昔类似 物在细胞增殖时参与到新合成细胞的染色体内标记细胞。在

19、 体内反应微弱的迁移增殖变化时，效果最优，在研究组织器 官的动力学方面效果优于其他染料。目前对干细胞定义的理 论众说不一 21-22,酶消化法提取的adsc中经传代纯化后 的细胞里真正含有干细胞来源的细胞量较少。一些理论认为 干细胞为性质较稳定的细胞，细胞长期处于静止状态，当受 到信号刺激时才会增殖22-23 o体外培养时，在一定的标 记时间内当干细胞处于静止状态时，则被标记的细胞将不是 干细胞性质的，研究单纯的标记率也就失去了意义。3. 6经edu标记后的adsc的增殖及转化情况也很重要。 经标记后的细胞最终要转移到体内进行示踪，理想的示踪剂 须对被标记细胞的增殖和分化无任何影响。但是活细胞

20、的增 殖及分化过程对外环境要求苛刻，容易受到外环境的影响。 几乎所有的示踪剂都会干扰细胞正常的生理状态，影响其增 殖分化。我们通过降低细胞的标记浓度及标记时间，在较小 的影响细胞增殖的情况下达到最大的标记率。我们行mtt实 验，以不标记的正常细胞作为对照，96孔板观察细胞的增殖 情况。得出在loum及12h的标记组合时，其细胞增殖的曲 线与对照组增殖的曲线较近。对细胞的影响较小，优于其他 组细胞。在定向分化的比较中，得到相同结论，说明10um 时，不仅标记率高，且对细胞的影响也小，从而得到优化的 标记率。体外状态与体内状态有不同程度的差异，今后，需 要大量的实验证实edu标记的adsc在体内的

21、转化过程，是 否影响体内adsc的代谢情况。并努力寻找对细胞活性影响 更小的标记物。4结论edu标记方法简单，需时间短，标记率高，作为探针标 记精确，特异性强，适合干细胞的示踪标记。台盼蓝排斥实 验，mtt实验证实10 um, 12h和5um, 24h组合标记的脂 肪干细胞在影响细胞增殖方面无明显差别。定向分化实验证 实了 10 um, 12h组合标记方法对细胞分化影响较小。本实 验筛选出干细胞标记的优化标记浓度和标记时间组合即 loum, 12h,且标记率能达到90%以上。为进一步测试体内 细胞标记率奠定了基础。参考文献1 katz aj, llull r, hedrick mh, et a

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