RNA提取策略及RT-PCR技术

1、rna提取策略及rt-pcr技术第一部分rna提収策略1、rna降解的原因内源性rnaase是造成rna降解的最重要原因,因为人体细胞自身就是几十分钟 （20min? ） mrna被降解-轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起來。外源性rna嗨也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤 其头发，灰尘，唾液，梨料于套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌乎套，在淸洁灰 尘少的地方提取rna,我上而说了内源性rnaase污染才是关键，所以冇些同志没冇注意这些对外源性 rnaase的防护rna也提取的很出色。但是如果你运气不太

2、好的话外源性rnaase污染影响很人的。2、样品的取材 我们抽提rna往往都是需要其mrna,而mrna的表达昴和细胞或者组织的生长状态息息 相关，我们収组织块应该避免収到坏死组织，而细胞我们应该在艮处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消 化要迅速，离心要稍为快些，英至可以不消化下來直接进入裂解步骤；此外还可以采取先虑荡敲击培养瓶 的方法使细胞和培养瓶的结合卜-降，然厉用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下來，这样细胞的代谢不会 明显的受到抑制。注意在平时传代的时候就耍注盘观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简 单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提r n a ）。3

3、、待提取样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是耍对这些保存方法的优缺点有淸醉的认识。根据你需耍的rna种类可以做简单的分类。包括rna病蒔rna , mrna （各种）,rrna等其中最容易降解或者破坏的就是mrna,最不容易损失的就是rna病毒rna （冈 为冇蛋口壳保护）。超低温保存：特指液氮保存不管纽织还是细胞如果需要其中的mrna必须在液氮中保 存，70度等方法都是错误的方法，在很短的时间内或许町以，但是长期是不町能的。2070摄氏度保存：rna病毒的rna可以在这个温度段安全的保存。但是其产生的mrna还是必须超低温保存。4度保存：有特殊的保护

4、试剂存在地情况f组织的保存：应该是离体后在lmin内就放入液氮或者保护试 剂中。山于捉取rna对组织块冇一定駅的要求，大约100mg居多（脂肪细胞需要的量多的多，因为细胞 是大大膨胀的），所以在取材前就需要明确到底你需要的组织大概多大是loomg,令少勿多。如果是取临 床的标本，就应该带上液氮縮子，depc处理的器械，锡箔纸，线等在手术室外答候，标本一切下就尽快进 行切割（大概loomg -块），包装（锡箔纸内），捆扎（方便在液氮讎子中寻找），迅速丢入液氮罐子中， 最好是lmin内完成（所以大家取材前一定要好好联系一下，不要到时候手忙脚乱的人_人）细胞的保存： 比较麻烦些，所以大多都是直接捉取

5、rna再保存。建议离心收集后用特殊保护试剂匝悬后保存。4、rna提取提取rna可以分为总rna, mrna, virus rna （rna病毒）儿类trizol r卩异硫氟酸呱苯酚法, 这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫亂酸肌裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，釋放出核 酸。释放出来的dna和rna由于在特定ph时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使 dna和rna分离开來。进一步通过冇机溶剂來抽捉沉淀rna,就可以得到纯净的rna；trizol m v-是mrc实验來的科沖家发明的方法，后來把专利卖给了 invitrogen/gibco, invitrogen/gib

6、co将 此方法推广到世界。他的trizol曾经由其他公司oem制作，现在已经自己生产。本來trizol是一个专利的 品牌，但是国内也有不少仿制的品牌，基木的原理是-样，配方稍有不同。rneasy kit： qiagen的王牌产 品，号称适用于各种rna抽提,其实在特殊的组织比如大脑，肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽捉试剂为佳。 此外细菌rna抽提也最好使用专用抽提试剂盒。这些产品qiagen都提供。注意凡是qiagen的试剂盒抽提 应该是没冇5s带的，因为它将5s破坏掉了。其他的比如roche, promega等都很好的是的。尤其promega性价比最高!注意各种方法对于组织都需要先臓磨，应该用陶

7、瓷碾磨器，同时一定要在碾磨同时不断的加入液氮。（少数 牛人号称从來不加液氮也提取的很好，我只能说他运气实在不错）。特殊的rna抽提试剂盒-mrna抽提试剂盒：单纯的抽提mrna的试剂盒很少见到有人在使用，但是其 具冇一般rna抽提试剂盒没冇的优点，在一些实验中冇出奇致胜的效果，推荐promega的总rna捉取kit, 效果与qiagen差不多，价格便宜多了，性价比最高的好东东！试剂盒提取的其优点有以下儿点：1、提取得mrna纯度高，因为对于很多实验rrna其实也是一种污染，我们只想rt我们需要的mrna, 但是如果用特异性引物或者随机引物就会连rrna -起rt,造成大量的我们不需要的cdna

8、出现。2、鉴定时观察是否有严重的dna污染时非常方便。mrna抽提厉电泳只是看到淡淡的一条短拖影带，此 时如果有dna污染可以很容易发现，因为背景很浅。3、rna的鉴定rna抽提出來z后，首先做的工作是分装保存，然后取其中一管用于鉴定。鉴定方法如下： 对rna的鉴定包括儿个方面，第一是数量的鉴定，第二是质量的鉴定，重点是质量的鉴定。一般的琼脂糖凝胶电泳，注;s：不要用甲醛变性电泳（乂不是做northern,实在没有必要）。电泳槽注意一定 不要用depc处理，一定要保证电泳体系中有少量的rnaase存在。分别在加样孔中加入1, 2, 3plrna 抽捉溶液。在旁边加入dna marker。1%琼

9、脂糖凝胶，10v/cm的屯压，屯泳lomin成像次，看电泳情 况，如果28s和18s还没拉开，继续屯泳lomin成像，如果任没冇拉开再次电泳5min。如果还没冇分开 多半28s已经：®到破坏，不可能看到典型的3条带了。好的rna的特征：a、rna应该呈现出3条rrna带。分别是5, 18, 28srrna的带。5s最好是要可见,除非抽提步骤中故 意将其破坏b、28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例关系均提示rna有一定程度的破坏。c、不能冇多的带出现。出现多的带冇两个可能，一是dna污染带，二是rna破坏断裂带。d、rrna z 间可以看到很淡的，雾蒙蒙的mrna拖带。e、琼脂糖凝胶

10、被rnaase处理厉电泳带基本消失，没有明显 的，边缘清晰的带残留（不用说这些就是明显的dan污染，而且是很大量的dna污染）如何用rnaase处理凝胶呢，为何要处理?？ dna是不会被rnaase破坏的，所以我们发现凝胶冇町疑的带 需要鉴定其到底是rna还是dna,如果是dna就冇比较人的问题了，如果是rna到不用过份担心，因为 只是提示有rrna断裂而已。我们可以在rna电泳完成后，把胶用薄牍手套包好（rnase的良好来源）， 放置5-10h后再次成像。如果前面起初的带减弱并模糊了说明是rna被降解，如果出现某个带或者拖影 一直不见模糊，那么dna污染的可能性就大了（由于rna被降解，有时

11、胶放置一阵后反而更清晰了。）注 意rna电泳加dna marker是很冇必要的（虽然很多白痴说不需要，那是因为没冇意识到具体dna marker 的作用）。dna marker加进去后，-來可以指示rna电泳中可疑带的位置，方便和在胶被放置后成像的结 呆进行比较。注意比如28s在某个位置，冇时候，胶被放置后28s降解带会前后移动，不一定就在最初的 位置形成 团降解后图彖。其次dna marker冇显示琼脂糖凝胶的功能状态的作用。eb等染色剂会挥发造 成成像没冇结果，dna在胶中也会轻微弥散，此时如果胶放置后发现上而空空的，没冇带出现，不要太高 兴，不一定就是rna在胶上降解完全了。事实上冇可能

12、是eb挥发引起胶不显色的结果，尤其冇些人把胶 一直泡在buffer中的情况。此外发现带型开始模糊也不一定就是rna降解的结果，也可能是核酸都在弥散 开。所以dna marker是非常重要的。第二部分rt-pcr一、一步法rt-pcr试剂盒子选择指南rt-pcr试剂盒最好的冇qiagen, invitrogen, stratagene三个品牌。但是价格都比较昂贵，不是首选。其 中promega是国内的首选，质量很好，价格介理，性价比最鬲的，投入和产出比最让人放心的产品。promega access rt pcr试剂盒介绍：使用的是l.amv reverse transcriptase (成功的r

13、t必须考虑消除 rna中的多数次级结构。为次，合成cdna的第1条链最好在较高的温度下进行。mmlv反转录酶能采用 的最高温度是42摄氏度左右，amv的活力在access rt-pcr系统中可以达到48摄氏度(但是实际上大多 都是45摄氏度完成rt)。因此，使用amv反转录酶，可以消除rna次级结构的负面影响)2.tfl dna polymerase这个是promega比较出名的taq酶，性价比虽然不如takara,但是也不失为一种pcr利器。3.mrna模板的量在l-100ng的范围内注意是mrna的量哟。建议加ipg总rna。4.不能用氯化镁代替硫 酸镁otfldna聚合酶在用硫酸镁和am

14、v/tfl5x反应液时活力有很大提高o5.accessquick rt-pcr system 就是预装的acess rt pcr system,山于镁离子己经加到反应体系中，所以使用自主性稍为受限，但是更 方便些，适合不太难的rt过程。价格稍为便宜些。性价比比较高，takara one step rna pcr kit 使用的是 1 .amv everse transcriptase 可惜 takara 在酶制作方面主耍强在pcr酶类，其他酶的制备不是很强。这也是该试剂盒不如promega的原因。2.amv -optimized taq takara的pcr酶制作功力实在不错。3.总rna少于

15、lpg建议不要少加，因为该试剂盒的 rt能力实在不让人彻底放心。但是多加模板会造成dna模板污染加重。价格比较低廉，性价比个人认为 不及promega试剂盒。takara mrna selective pcr kit运用了特殊的机理來选择性的扩增cdna。似乎说 是mrna selective是不对的，其他rna也是可以扩增的，关键是rt的选择啊。增污染dna模板的。本 来这个技术理论上是非常诱人的，可是考虑takara的功力还是劝大家慎用。成功的rt pcr的要素1、高质量rna成功的cdna合成來自髙质量的rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的 抑制剂，如edta或sds。

16、rna的质量决定了你能够转录到cdna上的序列信息量的最大值。一般不必使 mj oligo (dt)选择性分离poly (a) +rna。不管起始模板是总rna还是poly (a) + rna,都可以检测 到扩增结果。另外,分w poly (a) + rna会导致样品间mrna丰度的波动变化,从而使信息的检出和定 量产生偏差。但是我个人认为不会，除非mrna抽提试剂盒或者相关方法对内参以及目的基因的mrna冇 选择性，否则样本间抽提效率的差别完全可以用内参來校止。然而，当分析稀有mrna时，poly(a) + rna 会增加检测的灵敏度。为了防止痕fi rnase的污染，从富含rnase的样品

17、(如胰脏)中分离到的rna需 要贮存在甲醛中以保存高质量的rna,对于长期贮存更是如此。从大嵐肝脏中捉取的rna,在水中贮存一 个星期就基木降解了，而从大鼠脾脏中提収的rna,在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的 转录本对于痕量rnase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存rna样品的稳定性，可以将rna溶解在 去离子的甲酰胺中，存于7（fc。用于保存rna的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。來源于胰脏的rna 至少可以在卬酰胺中保存一年。当准备使用rna时，可以使用下列方法沉淀rna：加入naci至0.2m及4 倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10, oooxg离心5分钟。也

18、町以使用qiagen等公司的特殊rna保护 试剂。merck的inhibitor是世界第一，人家可以选择性使用。在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增 加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂耍在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如dtt）存在的 条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋白 rnase抑制剂仅防止rnase a, b, c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase,因此尽管使用了这些 抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。2、使用无rnaseh活性（rnaseh-）的逆转录酚逆转录酚催化rna转化成cdn

19、a。不管是mmlv还是amv, 在本身的聚合酶活性之外，都貝有内源rnaseh活性crnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna 引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna： dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的 rna模板不能再作为介成cdna的冇效底物，降低了 cdna介成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转 录酶的rnaseh活性将会人冇裨益。而且降低逆转录卿的rnaseh活性会加人rt師的热稳定性。通常冇点 突变和缺失突变两种，优先选择缺失突变的。此外amv酶热稳定性更髙，推荐。3、提高逆转录保温温度较高的温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量

20、。对于多数rna模板, 在没冇缓冲液或盐的条件下，将rna和引物（三种引物都可以的）在65°c保温，然后迅速置于冰上冷却， 可以消除人多数二级结构，从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤z后反应条件如何 设置我没有经验，是加入卿和莫他反应组分厉变性再rt还是直接开始rt程序？我认为后者才对。此外是 否可以考虑加入rna inhibitor更为安全一些。还可以通过直接将rna/引物混合物从65°c变性温度转到逆 转录保温温度，并加入预热的2x的反应混合物提高特异性（cdna热启动合成）。这种方法有助于防止较 低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化r

21、t-pcr所需的多种温度切换。然而某些模板仍 然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。上而简单的处理方法倒是不花钱，呵呵。对这些怵 1难模板的 扩增可以使用一些特殊的逆转录酶，逆转录反应可以置于较髙温度f进行，增加特异性，尤其是当使用基 因特异性引物（gsp）进行cdna合成时。如果使川gsp,确保引物的tm值与预计的保温温度相同。此外 注意不要在高于60c时使用oligo （dt）和随机引物。随机引物需要在增加到6ctc询在25°c保温10分钟。 此外rna在高于65°c时开始水解，对于slkb的rna第一链介成温度可以为70°c,对于lkb的rna则 需要65

22、°c。4、使用逆转录反应的增强剂包插甘汕和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链 的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的dmso而不影响superscript h或mmlv 的活性。amv也町以耐受最多20%的r油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵 敏度，可以加入10%的甘油并在45°c保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反 应中的浓度为0.4%,这不足以抑制pcr。5、rnaseh处理在pcr z前使用rnaseh处理cdna合成反应 可以提高灵斂度。对于某些模板，据认为cdn

23、a合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合,在这种情况下， rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低 拷贝的tuberous scherosisii rnaseh的处理加强了 superscriptii或amv介成的cdna所产生的信号。对 于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95°c保温的pcr变性步骤-般会将rna： dna复合物 中的rna水解掉。通常是不推荐此方法的。三种rt引物的选择oligo dt耍求rna必须冇poly a,所以真核生物的mrna适用。他卞要适合长链戏至全长mrna的rt, 这样对rna样品的质駅要求较高，最好不要有明显的dna污染，rna降解和rna断裂（如电泳屮出现多 条菲典型的带而又明确不是dna带那么就要考虎rna出现断裂的情况）m rt通常冇标准浓度，比较好掌 握。随机引物适合各种rna的rt,尤其适介模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低），关于是 否对具冇复杂二级结构的模板冇待殊的优点只能说maybe,事实上很多情况下我们是