【整理总结】关于MTT实验总结--心血啊！

1、【整理总结】关于mtt实验总结心血啊！mtt 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-（4, 5）-dimethylthiahiazo （-z-yl）-3, 5-di-phcnytctrazoliumromide, mtt 蓝为基础。mtt为黄色化合物，是一种接受氮离子的染料，可作丿ij 丁-活 细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下letrazol ium环开裂，生成蓝色的formazan 结品，formazan结品的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将mtt还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的n, n-二卬基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（

2、pll 4. 7）的mtt溶解 液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度0d值,以反映出活细胞数目。也可以用dms0來溶解。mtt粉末和溶液保存时都需要避光，川铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的h光灯来避 光，觉得这样比较好。mtt步骤如下：1：接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后,每孔加mtt溶液（5mg/ml用pbs <ph=7. 4>配）20ul.继续孵育4小时，终止

3、培养，小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。 毎孔加150ul dms0,振荡10分钟，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，徃酗联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值 为纵坐标绘制细胞生长曲线。注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，故后比色以空门 调零。mtt实验吸光度最后婆在0-0. 7 z间，超出这个范围就不是直线关系，tc50是半抑制率，意思是抑

4、制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各h的 抑制率，以药品的浓度为横处标，抑制率为纵朋标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度，就是1c50。 要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0. 1,抑制率为 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21, 0.06。代入计算公式:pm二0. 95pn=0. 06p=0. 95+0. 80+0. 65+0. 43+0. 21+0. 06=3. 1xm-lgo. 1=-1lgi=lgo. 1/0.0

5、1=1lgic50=-l-l*(3. l-(3-0. 95-0. 06)/4)=-3. 60251c50-0. 00025有一个公式可供参考；lgic50=xm-i(p-(3-pm-pn)/4)xm: ig最大剂量i：lg (最大剂量/相临剂量)p：阳性反应率z和pm:最大阳性反应率pn:最小阳性反应率抑制率-1-加药纽0d值/对照纽0d值公式中的故大垠小阳性反应率就是故大垠小抑制率例：用96孔板培养smmc-7721肝癌做mtt测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少mtt和dmso介适?根据书 上说的加200ull640,20ulmtt, 150uldms0加dmso z前要尽最去掉培养

6、液，便于dmso溶解甲喷颗粒进行比 色测定一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml, mtt加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓚洗掉，然后每孔加150ul dmso,在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。一般要低于1c50,避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1 /2-1/3 的ic50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10% (annexin v),细胞周期的亚go峰比较叨显.mtt试验的一些细节问题（一）细胞1选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约冇10

7、5个细胞。但由于不 同细胞贴準后而积并异很人，因此，在进行mtt试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同 接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验小每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证mtt结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多嫩感性降低，太少观察不到 湼界。2药物浓度的设定。一定婆多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据h己初筛的结果 缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根木不是药物的冇效浓度和时间。3时间点的设定。在不同时间点的测定od值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况， 画出变化的曲

8、线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个 时候的细胞削殖抑制表现的最明显）。4. 培养时间。2（）（）ul的培养液对于1（）的45次方的増殖期细胞來说，很难维持6紡，如果营养不够的话， 细胞会山増殖期渐渐趋向g0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5. mtt法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做mtt时，尽量无菌操作,因为细菌 也可以导致mtt比色od值的升高。6理论耒必都是对的。要根据自己的实际借况调格。7实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、mtt.二甲基亚砚。对照孔和加药孔都要加 细胞、培养液、mtt、二卩

9、基亚他不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。山于试 验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小t 10%胎牛血清的培养液进行。在泉色后，尽彊吸净培养孔 内残余培养液。（二）实验步骤贴壁细胞:i收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入i00u1,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘 孔用无菌pbs填充）。2.5%co2, 37°c孵冇，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物原则上，细胞贴壁后即 可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺

10、板，次日上午加药.一般5-7个梯度，毎孔looul, 设35个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%co2, 37°c孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4. 每孔加入20u1mtt溶液（5mg/nil, bp 0.5%mtt）,继续培养4h。若药物与mtt能够反应，可先离心麻 弃去培养液，小心用pbs冲2-3遍麻，再加入含mtt的培养液。5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。6每孔加入150山二甲基亚飒，置摇床上低速振荡lomin,使结品物充分溶解。在酶联免疫检测仪od49（）nm 处测量各孔的吸光值。7同时设置调零孔（培养基、mtt、二甲基业砚），对照孔（细胞、相同浓度的

11、药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砚）悬浮细胞：1收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度lxl06/ml,按次序将补足的164（）（无血清）培养基40ul :加 aclinomycind （有毒性）10ul用培养液稀释l?g/ml,需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；需检测物10ul；细胞悬液50ul （即5xl04ccll/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100?（储存液 100 1640）。2. 置37°c, 5%co2孵育1648小时,倒置显微镜下观察。3. 每孔加入10 ul mtt溶液（5 mg/ml,即0.5%mtt）,继续培

12、养4 h。（悬浮细胞推荐使用wst-1,培养 4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪od570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值） 4离心（1000转xlomin）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul"甲基亚讽,置摇床上低速振荡10 min,使结 晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值。5同时设置调零孔（培养基、mtt、二甲基亚血），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质.培养液、mtt、二甲基亚砚），每纽.设定3复孔。（三）mtt的配制mtt 般最好现用现配,过滤后4oc避光保存两周内冇效，或配制成5mg/ml保存在2（）度长期保存，

13、避 免反复冻融，故好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把mtt粉分装在ep管里，川的时候现配，££接往培养板中加,没必要-下子配那么多，尤其当mtt变为灰绿色时就绝对不能再川了。mtt冇致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜于套配成的mtt需要无菌，mtt对菌很敏 感:往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。配制mtt时用pbs溶解，也冇人用生理盐水配,60°c水浴助溶。pbs配方：nacl 8g kcl 0.2g na2hpo4 1.44g kh2po4 0.24g 调 p

14、h 7.4 定容 il（四）关于细胞的接种（铺板）细胞过了 30代以后就不要用了，因为状态不好了;培养板要用好的（战好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/inl左右时，所测得的0d值的区间即细 胞抑制率（或者用值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显， 太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都 会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而mtt细胞密度多采ffl 10000/ml, i00ul/?lo 细胞密度耍根据不同细胞的特点来圧如杲

15、你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你 做的药品对细胞具冇抑制作用那么取人:点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每 孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.其它的声音：1首先细胞的接种密度 定不能过大,-般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对丁肿瘤细 胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，mtt方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔, 太少的话sd值会很大。2.mtt木身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新于，20%的波动也是常见的, 所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一

16、定要过关。3我做的是肿瘤细胞的mtt实验，这种细胞长的很快开始我是用100000/ml的浓度來接种的，结果细胞长 的太满结果:是没冇梯度也没冇线性关系.后來调整浓度，用过4000()8()()(x)/ml的浓度都做过mtt实验，结果 发现做的结果比较好点的是60000-70000/ml的浓度组的jij 40000/m的浓度的组，由于细胞少，药物作用的 梯度还是有，只是没有很好的线性关系还有根据细胞牛长速度以及药物的特性(有吋间依赖性和浓度依赖性 的药物)來确定培养时间是48小时还是72小时.注虑细胞悬液定耍混匀,已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以毎接儿个就要再、混匀 一下。加样

17、器操作耍熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管粘确得多，但是如果操作不熟，cv 会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1吹打时悬液总虽不能太多，达到吸管吸液呆的3到4倍，町能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装 34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。2.吸管的吸液暈最好在1ml心右:吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易 起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量lml多的吸管，总液量在5ml左 右为益。3吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是

18、吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30-50次棊本就差不多均匀了。加细胞 的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取 悬液。）5向每孔小用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一 堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速 度不能太快也不能太慢。我习惯毎块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返冋复3下移动，目 的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是mtt实验的关键，也是皋础，定要练好。曾经有同学川漩 涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不耍采川这种方法混匀细胞。（五）加入mtt个人认为mtt最关键的是你的细胞数忖和你加入真正起作用的的mtt的适当比例，具体细胞数目和真正 起作用的的mtt z间的关系确实不好确