蛋白类酶的分离纯化ppt课件

1、细胞构造与酶分布3.1 3.1 酶的提取、分别纯化技术道路酶的提取、分别纯化技术道路细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分别纯化酶分别纯化酶浓缩酶浓缩酶储存酶储存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心，过滤、沉离心，过滤、沉淀、层析分别、淀、层析分别、电泳、萃取、结电泳、萃取、结晶等分别方法晶等分别方法酶的纯化过程，约可分为酶的纯化过程，约可分为三个阶段：三个阶段：(1) (1) 粗蛋白质粗蛋白质 (crude (crude protein): protein): 采样采样 均质均质突破细胞突破细胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多运用多运用 盐析沉淀法；可盐析沉淀法；可以粗略去除蛋

2、白质以外的以粗略去除蛋白质以外的物质。物质。(2) (2) 部分纯化部分纯化 (partially purified): (partially purified): 初步的纯化，运用各钟初步的纯化，运用各钟 柱层析法。柱层析法。(3) (3) 均质酶均质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目的酶目的酶的进一步精制纯化，可用的进一步精制纯化，可用制备式电泳制备式电泳 或或 HPLC HPLC。酶分别纯化不同阶段3.2 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细许多酶存在于细胞内。为了提取胞内。为了提取这些胞内酶，首这些胞内酶，首先需求对细胞进先需求对细胞进展破碎处置。展破碎处置。

3、1机械破碎机械破碎2物理破碎物理破碎3化学破碎化学破碎4酶解破碎酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿外表活性剂：外表活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法经过机械运动产生的经过机械运动产生的剪切力，使组织、细剪切力，使

4、组织、细胞破碎。胞破碎。经过各种物理要素的经过各种物理要素的作用，使组织、细胞作用，使组织、细胞的外层构造破坏，而的外层构造破坏，而使细胞破碎。使细胞破碎。经过各种化学试剂对经过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞膜的作用，而使细胞破碎细胞破碎经过细胞本身的酶系或经过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，外加酶制剂的催化作用，使细胞外层构造遭到破使细胞外层构造遭到破坏，而到达细胞破碎坏，而到达细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理3.3 3.3 酶的提取酶的提取酶的主要提取方法酶的主要提取方法1 1、沉淀分别、沉淀分别2 2、离心分别、离心分别3 3、过滤与膜分别、过滤与膜分别4 4

5、、层析分别、层析分别5 5、电泳分别、电泳分别6 6、萃取分别、萃取分别1 1、沉淀分别、沉淀分别沉淀分别是经过改动某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度沉淀分别是经过改动某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分别的技术过程。降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分别的技术过程。在盐浓度到达某在盐浓度到达某一界限后，酶的一界限后，酶的溶解度随盐浓度溶解度随盐浓度升高而降低，这升高而降低，这称为盐析景象。称为盐析景象。盐析的主要原理盐析的主要原理在于高浓度盐离在于高浓度盐离子与蛋白质争夺子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋水化水，破坏蛋白质分子外表的白质分子外表的水化膜，同

6、时由水化膜，同时由于反离子作用，于反离子作用，也影响蛋白质分也影响蛋白质分子所带电荷子所带电荷 2 2、离心分别、离心分别3 3、过滤与膜分别、过滤与膜分别过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同外形过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同外形的物质分别的技术过程。的物质分别的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需求选用。据需求选用。过滤过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为

7、过膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同小不同 ) ) 。膜分别膜分别加压膜分别加压膜分别 微滤微滤超滤超滤反浸透反浸透电场膜分别电场膜分别 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 分散膜分别分散膜分别 透析透析根据膜资料和不同进料液的特性，商根据膜资料和不同进料液的特性，商品运用的膜产品通常采取如下几种构品运用的膜产品通常采取如下几种构造方式：管式；中空纤维；卷式；平造方式：管式；中空纤维；卷式；平板式。板式。膜技膜技术术 截留物尺寸截留物尺寸nm分子量分子量 推进力推进力 分

8、别机理分别机理 微滤微滤MF 20 (40,000) 压力差，压力差，100kPa 100kPa 筛分筛分 超滤超滤UF 120 (10,000-40,000) 压力差压力差100kPa 100kPa 筛分筛分 纳滤纳滤NF 1 1 (100(1001000) 1000) 压力差，压力差，100) 压力差，压力差，1000kPa 优先吸附、优先吸附、溶解分散溶解分散 四种常用膜分别技术的根本特征四种常用膜分别技术的根本特征 四种常用膜分别过程的截留特性四种常用膜分别过程的截留特性层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分别方法。它是利用混合物中各组分的物理化别

9、方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的两个相中，其中一个相为固定的( (称为固定称为固定相相) )，另一个相那么流过此固定相，另一个相那么流过此固定相( (称为流动称为流动相相) )并使各组分以不同速度挪动，从而到达并使各组分以不同速度挪动，从而到达分别。分别。 1 1、离子交换剂的、离子交换剂的选择应根据欲分别选择应根据欲分别组分的特性和要求，组分的特性和要求，过强的吸附以及极过强的吸附以及极端的洗脱条件都能端的洗脱条件都能够呵斥活性分子的够呵斥活性分子的变性失活；另外溶变性失活；另外溶液的

10、液的pHpH直接决议离直接决议离子交换剂活性基团子交换剂活性基团及组分别子的解离及组分别子的解离程度，从而影响了程度，从而影响了离子交换剂的交换离子交换剂的交换容量和交换的选择容量和交换的选择性性凝胶层析的根本原理凝胶层析的根本原理凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的

11、微孔内，不断地进出于一个个颗入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下挪粒的微孔内外，这就使小分子物质向下挪动的速度比大分子的速度慢，从而使混合动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而到达分别的目的顺序先后流出层析柱，而到达分别的目的的Ve-V0VIVe=K1-K2 lgM在实践运用中，常以相在实践运用中，常以相对洗脱体积对洗脱体积Kav对对lgM作曲线，称为选择曲线作曲线，称为选择曲线相对洗脱体积是指组分相对洗脱体积是指组分洗脱体积与层析柱内凝洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积

12、之比值胶床总体积之比值KavVe/VtlgMKav3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.001.00.5选择曲线的斜率阐选择曲线的斜率阐明凝胶的特性。每明凝胶的特性。每一类型化合物都有一类型化合物都有其各自特定的选择其各自特定的选择曲线。如此图所示，曲线。如此图所示，可以经过凝胶层析可以经过凝胶层析测定物质的相对分测定物质的相对分子质量子质量亲和层析的四个要素亲和层析的四个要素常用的亲和介质及专注性配体常用的亲和介质及专注性配体根据欲分别组分与配基的结合特性根据欲分别组分与配基的结合特性, ,亲和层析可亲和层析可以分为：以分为：共价亲和层析共价亲和层析疏水层析疏水层析( (要区别疏水层析

13、与反相层析要区别疏水层析与反相层析) )金属离子亲和层析实验方法见蛋白质工金属离子亲和层析实验方法见蛋白质工程程p218p218免疫亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析 5 5、电泳分别、电泳分别带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极挪动的过程称为电泳。的电极挪动的过程称为电泳。颗粒在电场中的挪动速度主要决议于其本身所带的颗粒在电场中的挪动速度主要决议于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒外形和颗粒大小的影响。此净电荷量，同时受颗粒外形和颗粒大小的影响。此外，还遭到电场强度、溶液外，还遭到电场强度、溶液pHpH值、

14、离子强度及支持值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。体的特性等外界条件的影响。 纸电泳纸电泳自在电泳自在电泳薄层电泳薄层电泳凝胶电泳凝胶电泳薄膜电泳薄膜电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳聚丙烯聚丙烯酰胺凝酰胺凝胶电泳胶电泳琼脂糖琼脂糖电泳电泳延续凝胶电泳延续凝胶电泳梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳不延续凝胶电泳不延续凝胶电泳SDS-凝胶电泳凝胶电泳电电泳泳制备式电泳通常以不含制备式电泳通常以不含 SDS SDS 的原态的原态 disc-PAGE disc-PAGE 进展，以便回收进展，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否那么效果具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否那么效

15、果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。6 6、萃取分别、萃取分别萃取分别是利用物质在两相中的溶解度不同萃取分别是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分别的技术。萃取分别中的两相普通而使其分别的技术。萃取分别中的两相普通为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取有机溶剂萃取双水相萃取双水相萃取超临界萃取超临界萃取反胶束萃取反胶束萃取 各种双水相系统各种双水相系统图图4 47 7 双水相系统相图双水相系统相图在双节线在双节线TC

16、BTCB下方区域下方区域是单相区，上方是双相是单相区，上方是双相区。区。T T点和点和B B点分别表示点分别表示到达平衡时的上相组成到达平衡时的上相组成和下相组成，在同不断和下相组成，在同不断线上的各点分成的两相，线上的各点分成的两相，具有一样的组成，但体具有一样的组成，但体积比不同积比不同当系线当系线TMBTMB下移，长度下移，长度减小，两相之间的差别减小，两相之间的差别逐渐减小，到达临界点逐渐减小，到达临界点C C点时，系线长度为零，点时，系线长度为零，到达均相。到达均相。聚合物聚合物P%P%B B T TB BC CT T 聚聚合合物物Q Q或或盐盐% %MpTGLSSCF图图4-8 4-8 超临界系统相超临界系统相超临界流体的显著特点：超临界流体的显著特点：其物理特性和传质特性其物理特性和传质特性介于液体和气体之间，适介于液体和气体之间，适于作萃取溶剂；于作萃取溶剂；其具有和液体同样的溶其具有和液体同样的溶解才干，具有很高的萃取解才干，具有很高的萃取速度；速度；随温度和压力变化，其随温度和压力变化，其对物质的萃取具有选择性，对物质的萃取具有选择性，萃取后易分别；萃取后易分别；其黏度接近于气体的黏其黏度接近于气体的黏度，利于物质的分散；度，利于物质的分散；某些超临界流体的超临界点和超临界密度某些超临界流体的超临界点和超临界密度Resolution分辨率分辨率Spe