[精品]中药长期毒性试验研究问题探讨

1、中药长期毒性试验研究问题探讨 摘要近年來中药注射剂临床应丿u中不良反应的增加，引起人们对中药注射剂安全性的重视，中 药新药研究技术要求对中药注射剂毒理学研究提出了严格的要求。本文提出屮药注射剂长期毒性 试验研究中常见问题溶血性、刺激性、过敏反应等制剂安全性问题对毒理学试验研究的影响, 长期毒性试验剂量与用药周期的设计、给药方法及对实验结果分析方面的问题。总结了上述问题, 并提出一些看法与解决办法。关键词 中药注射剂 长期毒性 制剂安全性随着屮药现代化的进程、中药新剂型的研究逐年增加，特别是近年來新药研究热潮的出现，捉 出中药注射剂的注册申请数目逐年增加,1998-2000年8个，而2001-2

2、003年上升到60个。 由于中药新药研究技术要求和新的药品注册管理办法的实施，对中药注射剂提出了新的 毒理学要求；外加研究单位与委托单位的h的不完全一致或沟通不够等种种原因，致使中药注射 剂，特别是静脉给药注射剂的毒理学研究常常岀现各种齐样的问题。笔者就五年來所进行的实验 和审阅过的近百个毒理学资料中岀现的问题提出来与同行们共同探讨，以期今后在痔理学研究特 别是中药注射剂长期再性试验研究中避免出现不该出现的问题，减少投入和研究工作的反复。一、中药注射剂制剂安全性的问题中药注射剂不同于一般口服制剂，首先是要满足注射剂安全性的要求，对新药临床研究用药样 品都要求进行全面的制剂安全性试验，但对用于毒

3、理学研究样品往往没冇进行相应的研究，或仅 对溶血、热原关注较多。中药制剂毒性相对较小，长期痔性试验剂量往往可达临床用药剂量的儿 十倍，甚至百倍以上。而如此高的剂量，因限于给药体积，增加药物浓度成了提高剂量的常用方 法。约物浓度的增加，可引起注射剂性质的改变，如渗透压、ph值、刺激性、溶血性等改变， 对于溶解件不好需采用助溶剂的药物更为明显。这些改变导致毒理学样品本身已不完全符合注射 液的要求，如就此样品进行长期毒性研究往往出现各种问题。1. 溶血作用对临床用药样品必须进行溶血性试验，符合要求者方可应用于临床。毒理学用药 样品因浓度增加易出现溶血反应，如未进行木项研究而百-接进行长毒试验研究，很

4、町能i大i溶血而 致动物死亡。在犬静脉注射或人鼠腹腔注射预试验中対溶血作丿j较弱的受试药物，短时间内不易 观察到溶血反应的影响，但在长期用药后势必引起体重下降、精神萎糜、rbc、hgb的降低、 tbil的升高筹毒性反应。因此，对含冇具冇溶血作用的吐温、peg-400等助溶剂，皂幷或英他 可能引起溶血的成份者，应进行多个稀释度的溶血试验，以确证没冇溶血作用的浓度。如确实需 耍提高药物剂量，在犬静脉给药时可考虑采用具有细胞牍稳定作用的匍萄糖注射液作为溶剂，或 增加给药体积，同时控制给药速度。笔者进行过一枝黄花注射液的急性毒性预试，给小鼠iv 0.1ml/10g体重的2.0g牛药/ml的受 试验物(

5、20g/kg),给药后四小时内除活动减少外，未见其它界常改变，次口 10只小鼠全部死 亡。进行溶血试验后表明本2.0g生药/ml 枝黄花注射液有明显溶血作用，1.0g生药/ml有 轻度溶血作用。再次采用1.0g生药/ml,给小鼠iv0.2ml/10g体重(20g/kg),结果仅有30% 动物出现死亡。因溶血作用，对于同是20g/kg的给药剂量，只因药物浓度的不同，结果可存 在很人的差别。2. 刺激性 对于样品屮存在皂背、挥发油、具冇刺激性的助溶剂等成份，在浓度增加吋势必 增加刺激性。具有刺激性的受试药物，长荷试验釆用肌肉注射易出现肌肉组织变性、坏死，特别 是用药周期较反者；对于一些人鼠腹腔注射

6、中出现扭体反应或犬静脉注射出现红肿的样品，在长 毒试验中均要注意刺激性対最后试验结果的最后影响。具有制剂刺激性的受试药物对人鼠的腹腔 注射影响大于犬的静脉注射，原因是药物在腹腔屮停留时间较长，对腹腔内各脏器与腹腔粘膜长 期反复刺激易出现腹腔内的脏系数増加、脏器粘连、甚至脏器变性坏死等病变，还有可能引起非 腹腔内容的脏器改变。中药注射剂的刺激性対试验结果影响较人，可直接影响到対约物安全性的评价。我们曾做过一 个用40%peg-400做溶剂的难溶性中药注射液的急性毒性试验，试验结果表明溶剂的ld50 与含药物样品的ld50极为相近。另进行清开灵冻干粉急性毒性试验吋发现给小鼠iv1.82g/ml 可

7、见明显的刺激反应，小鼠在给线过程即可死亡，解剖可见肺脏明显充血，进行稀释一倍后反应 明显减轻，两借稀禅后未见动物死亡，原因可能是方屮高浓度的去胆氧酸和胆酸引起。可见刺激 性可明显影响毒理试验结果。対于含有人参、黄便、三七等含皂昔成份药材或石昌蒲、金银花、 柴胡等含有大量挥发油成份药材的受试药物在试验中应注重刺激性问题。我们实验室进行了注射 用参麦冻干粉和参茂注射液长期毒性试验均存在人鼠长毒试验中高、中剂量组川:、脾、肾等脏器 系数明显增加，但未见明显病理改变，部分动物出现腹腔脏器粘连，剂量和关性明显。在犬的静 脉注射中未见脏器系数增加，但高、中剂量组犬肾小管出现浊肿、水样变、轻度坏死等病理改变

8、。 对具有刺激性的受试约，除考虑药物因素外还应考虑辅料原因，如同辅料有关试验应增加溶剂对 照组，同时考虑增加给药体积或一h给药次数來减少药物刺激性对试验结果的评价。3. 过敏反应 在beagle犬长毒试验屮常发现静脉给药过程中岀现呕吐、流涎、腹泻等消化 道反应，部分试验还伴有皮肤潮红，眼睑、耳朵水肿增厚，皮疹等过做症状，严巫者会出现休克, 反应不严重者一般在停药30min-60min后可恢复正常。有上述反应的人部分受试药物在豚鼠 全身过敏和人鼠被动皮肤过敏试验中均未表现出过敏反应。经了解这些样品中多数有采川助溶 剂，以吐温-80用得戢多。为确证助溶剂可否引起过敏反应，我们采用含0.5%的吐温-

9、80的牛 理盐水注射液给beagle犬进行滴注，在注射5-6min （滴速30d/min）后即对出现叨显的过 嫩症状，随给药量的增加反应加巫，在此停止滴注60min后一般可恢复正常。次i我们给同一 批beagle犬注射不含吐温的生理盐水注射液50ml,未见任何异常反应。第三口再次给丁含吐 温的牛理盐水注射液，又出现上述症状。可以肯处beagle犬对吐温很敏感，这点同文献中报道 一致的1-2。在此z厉我们进行一淸热解壽注射液长壽试验时乂出现类似现象，同委托方沟通 后将助溶剂叶温80从制剂中去除后，试验全过程未出现头面部、耳朵、腹部等皮肤发红、流涎、 烦躁不安等过敬反应。故当岀现过敏反应时，则应从

10、药物处方、提取工艺、制剂处方筹方曲分析可能引起过敏原i大i。 如是药物原因应建议委托者考虑述行廿发的可行性或考虑改进工艺解决过敏问题；如是辅料引起 异常，除考虑给药浓度因素外，应考虑更改辅料。上述三方面问题，在中药注射液长期毒性试验屮是经常遇到的问题。因此对毒理学试验用药样 品非常有必要进行制剂女全性试验研究,如在试验过程中发现界常者，应及时同样品提供者联系, 了解样品的制备情况，分析具体原因。姿托方经常会因保密处方或工艺而不愿告诉再理试验者, 这非常不利丁试验的顺利廿展，止确评价药物的安全性。双方共同考虑原因所在，确定进一步研 究方案，这样才有利于达到长期毒性试验h的发现毒性反应、寻找毒性靶

11、器官和确定安全剂 量，二、实验设计与实验过程中常见的问题各类有关新药研究专著中均有长期毒性试验设计方面的内容，单从文献资料看长期毒性试验方 案的设计较简单，实则是个很难的问题，因它不但关系到多方面专业知识，还同实践经验有着很 大关系。对于首次进行毒理学研究或经验不足者易照搬书上内容，在测不出ld50时高剂量就 设为临床川药的50倍或一味追求毒性剂竝，而对药物的本身及将來临床川药的实际情况未加考 虑，此类研究方案得出的研究结果不但达不到毒理学研究真止h的，且往往在试验屮会出现各种 各样的问题。屮药新药研究技术要求对屮药注射剂进行了专项要求；药品注册管理办法将 中药注射剂单独归为七类，并在说明中强

12、调大小水针、输液及冻干粉之间的剂量改进均纳入新药 要求；新的指导原则即将出台等均增加了中药注射剂毒理学研究的难度。在实验设计与实验过程 中更应考虑周全，以免投入人量的时间和费用后得出的结果却不能充分反应受试药物的毒性，为 临床用药提供毒理学实验依据，而要从头再來。1. 剂量设计长期毎性试验剂量设计一般原则3是高剂量组原则上耍求动物产生明显的或严 重的毒性反应，低剂量略高于药效学屮的有效剂量但应不出现毒性反应，再设一个出现轻度毒性 反应的屮间剂量。在1993年卫生部药政局颁发的屮药新药研究指南屮对大鼠剂量设计方 而的要求冇一条是“如果急性毒性试验结果毒性很低，测不出ld50o也未见毒性应者，可设

13、臥 低两个剂量组，高剂量组一般为拟用于临床剂量的50倍以上（有因难时，可适当减少剂量）并 应高于药效学试验之高剂量。”,对犬也有类似规定。有的研究者怕做出毒性或为了满足委托者 的要求，特别是在受试药物价格较高时，就根据这条高剂量仅进行和当于临床用量的50倍，或 略髙于50倍的剂星（以60倍为高剂量居多）。笔者认为此条规定是基于两方面原因，一方面 是对于毒性较小的屮药制剂，长毒剂量设计过高没有实际意义；另一方血是一些原三、四类口服 制剂小有些药材不经提取宜接打粉入药或只是粗提，限丁溶解度或给药体积，无法做到较高剂量 给药。对于中约注射剂，特别是进行过多次处理，提取有效部位或有效成份的，剂量要达到

14、高于 拟用临床剂量的50倍或上百倍多数情况下是nj以做到的。对此，长毒试验中高剂量-般以出现 明显毒性反应为宜，如药物毒性确实很小，如银杏叶注射剂，高剂最町设为冇效剂量的10-15 倍。如果髙剂量设计较低，即便出现一些轻度毒性反应，也不能为临床用药提供充分的毒理学信 息。中药注射液以用于急、重症者为多，且临床适应症较多。临床上对不同症候的疾病用药剂量 差别较大，如川丁治疗休克的参麦注射液4-6临床上对不同原因的休克与休克的不同时期川量 相差很大，可以从一次用量20ml至100mlo如在临床前是按20ml进行剂量设计，则不能支 持临床的100ml用量。不同研究者对剂量设计原则理解不同，另有些研究

15、者为了做出毒性结果，一味增加剂量，高剂 量达到临床拟用量的两三白倍，组间剂量比乂不大，如高、中、低三个剂量组采用4:2:1进行 递减，则低剂量为临床拟川量的四五十倍大有可能。结果三个剂量均出现毒性反应，试验结果难 以为临床提供安全用药剂量。无论是剂量过高，还是偏低均不能达到长期壽性试验日的。为了真 止达到毒理学试验h的,在剂址设计时-处耍综合考虑急性毒性试验结果、长期毒性预试验结果、 药物已有的其它研究结果及处方和近药物的临床用药情况，确定合理的用药剂量。对毒性较大的 受试药物，预试验显得尤为重要；对于毒性较小的受试药物高剂量可采用最大给药量或采用药效 学同种动物有效剂量的10-15倍进行。低

16、剂量可参照药效学试验，而中剂量可采川高剂量的 1/3-1/5或采用高、低剂量的几何均数。也可借鉴于袁们俊等人7归纳的半数致死量法、最大 耐受量法，等效剂量法等儿种方法。2. 用药周期中药新药研究技术要求规定中药注射剂长期毒性用药周期为临床疗程的34倍, 啮齿类一般不超过6个月，非啮齿类不超过9个月。临床上需反复长期用药者按最长周期进行。 对于中药注射剂一般人第一反应是试验进行6个月或9个月难以做到或不可能做到。为减少研 究难度往往按较低的要求进行设计，特别是对于一些长疗程的药物，如癌症、肝炎方面的注射剂。 笔者认为不能仅根据临床研究方案中的疗程來设计试验周期，如用于治疗冠心病的药物，临床疗 程

17、定一般为2周，如仅按三倍周期进行为期6周的试验是达到临床实验用药要求的。而新药上 市后临床常会用到3周或更氏一些，如复方丹参注射液、香丹注射液、血栓通注射液等，临床 用药3周者大有所在。因此，我们认为应结合临床实际应用情况考虑试验周期，如对于中风、 胸痹的药物，以进行3个月长壽为宜。笔者见过北京某单位完成一中药抗肿瘤注射液的长期壽 性试验，根据研究单位最初提供的临床疗程为一个刀而设三个刀，但在最后临床方案屮是连续用 药两个疗程为一个观察期（中药临床研究指导原则规定抗肿瘤治疗药一般疗程不少于两个月）， 这样临床试验实际上用药时间是两个月。可见三个月的长期再性资料不能支持用药两个月的临床 试验的。

18、为此，作为一项毒理学研究的方案设计者应结合药物实际情况从多方而考虑长毒川约周 期的设计是十分重要的。3. 给药方法一般人鼠进行长期连续静脉注射较难实施，而肌肉注射乂有限丁用药体积 (0.1-0.2ml/次)，两者多数采川腹腔注射或其它途径代替，但在具体实验中存着用药体积、给药浓度、每周川药次数等方法问题。特别是临床川约拟采川滴注方而的药物，研究者为了减少工 作量，常减小给约体积，缩短单次给药时间。对于药理作用较强的受试药物，特别是作用于心脑 血管的药物，如不注意给药体积和速度，在给犬用药时最容易出问题。常常冇研究者向受试药物 提供者反应药物毒性太大，一用药就出现恶心、呕吐、血压下降、心律失常、

19、山肢发软或休克等 症状。笔者实验室曾进行一用于脑出血的注射液长毒试验，第一次预试验时采用2ml/kg进行 推注，结果给约还未进行到一半时，beagle犬已进入休克状态，心率明显减慢至每80多次、 出现早搏，后改为8ml/kg进行滴注，结果未出现界常。对于药理作用较强、有刺激性或溶血 性的药物，应尽可能注重给药体积、给药速度，以免因川药方法引起毒性反应而影响对受试药物 的评价。以笔者实验经验，对于beagle x静脉滴注10ml/kg或更大一些是町行的，一般药物 以 30-60d/min 为宜。4. 检测指标长期毒性试验中一般观察，血液学和血液生化指标，系统解剖和病理学检查，对 于非啮齿类的大动

20、物心电图、尿常规的检査等常规指标检测我们-般不会遗漏。对作用靶器管和 注射部分的观察往往易被忽略。笔者曾看过一治疗糖尿病视网膜与神经病变的药物的毒理申报资 料，在病理学检查中未进行胰腺、视神经及视网膜的观察。不少注射剂长期毒性资料中没有注射 部位的描述或病理结果，这是一项缺憾，其实这部分结果可很好地作为观察连续给药刺激性的数 据。除对一些常规指标的检测外，对试验中出现界常的应增加相应指标的测定，以便分析出现界 常的真止原因，如对在犬试验中其发现血细胞下降时，最好增加骨髓分析。新的指导原则将增加 检测指标的要求，在进行方案设计时应充分理解各项技术要求同时考虑受试药物的作用特点，确 定合理的检测指标。三、对试验结果的分析描述在一些新药巾报资料或毒理学文献报告中可见以简单描述试验结果为多，对出现变化指标未加 分析而是留给看资料人自行分析。还有对于体重、进食量、血液检查等变化雌雄动物耒分开统计; 对发牛-变化的指标只写冇无统计学意义与标明増加还是降低，对丁变化原因未做进一步的分析讨 论，或是增加一句均在止常范围z内，但并未提供本单位的止常值范围。大体解剖和病理学检查 是存在问题最