生物化学技术实验

1、生物化学技术实验部分生物化学技术实验部分(2010版版)生物化学研究的核心任务：生物化学研究的核心任务：阐明阐明生命现象生命现象的的分子机理分子机理。 生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心、过滤解、差速离心、过滤精制后的蛋白质精制后的蛋白质一、蛋白质的性质：一、蛋白质的性质：二、分离纯化蛋白质的主要方法二、分离纯化蛋白质的主要方法 （一）根据溶解度差异分离：选择性沉（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法淀法 等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法 利用生化物质在不同浓度利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法离的方法。 降

2、低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间间的作用力，因而聚集在一起。的作用力，因而聚集在一起。membrane protein 有机溶剂沉淀法water-solubleprotein溶解度water-solubleprotein-+-+-+-+-+-+-+-有机溶剂solvent %= hydrophilic分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。易使某些蛋白质或酶变性。易使某些蛋白质或酶变性。 乙醇、丙酮乙醇、丙酮 丙酮沉淀能力比较强丙酮沉淀能力比较强 温度的控制温度的控制有机溶剂的选择有

3、机溶剂的选择ph值的选择值的选择离子强度的选择离子强度的选择分离溶液浓度的控制分离溶液浓度的控制及时处理沉淀物及时处理沉淀物 全部操作过程应在全部操作过程应在低温低温条件进行，而且最好在条件进行，而且最好在同同一温度一温度下进行。下进行。 加入的有机溶剂温度要加入的有机溶剂温度要预冷预冷。 ph值影响蛋白质在有机溶剂中值影响蛋白质在有机溶剂中溶解度溶解度，分级沉淀时更应严格控制分级沉淀时更应严格控制ph值。应选择值。应选择ph值在等电点（值在等电点（pi）附近。）附近。 离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶 在 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 度 。

4、离 子 强 度酶 在 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 度 。 离 子 强 度0.05mol/l为好，过大则需更多的有机溶剂为好，过大则需更多的有机溶剂来沉淀。来沉淀。 由盐析法沉淀得到的蛋白质或酶，用有机溶由盐析法沉淀得到的蛋白质或酶，用有机溶剂沉淀前，一定要剂沉淀前，一定要先透析除盐先透析除盐。 蛋白质浓度愈大，加入有机溶剂后，蛋白蛋白质浓度愈大，加入有机溶剂后，蛋白质沉淀量就愈多。质沉淀量就愈多。 蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。溶剂用量。 浓度过大，共沉淀现象增加，浓度过大，共沉淀现象增加，不利于分级不利于分级沉淀。沉淀。 沉淀物要立即用

5、水或缓冲液溶解，沉淀物要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。降低有机溶剂的浓度。 （二）、根据（二）、根据 分子大小和形状的差异分子大小和形状的差异分离分离透析和超滤法：除去小分子物质透析和超滤法：除去小分子物质半透膜阻留半透膜阻留pr分子，分子，而让小的溶质分子和而让小的溶质分子和水通过，以达到除去水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。（盐、低分子酸等）。施以一定的压力使小施以一定的压力使小分子溶质通过一半透分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋孔大小截留相应的蛋白质分子白质分子沉降的速度与颗粒的大小沉降的速度与颗粒

6、的大小和密度有关。和密度有关。离心后按其离心后按其沉降的速度不同，彼此分沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采定位，针刺或冰冻切片采样分析样分析密度梯度离心法密度梯度离心法 凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（介质：交联葡聚糖（sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（ bio-gel p ，），） 琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose，bio-gel a）凝胶过滤法凝胶过滤法支持物的选择：支持物的选择：（三）（三） 根据电荷性质的差异分离根据电荷性质的差异分离 1、电泳和等电聚焦法：、电泳和等电聚焦法：普

7、通电泳、等电聚焦、双向电泳普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、脉冲电泳、毛细管电泳毛细管电泳支持物支持物： page 、琼脂糖胶等、琼脂糖胶等polyacrylamide gel electrophoresis (page)molecules are separated by size and charge in an electric field.isoelectric focusing relies on the migration of charged proteins in an electric field等电聚焦法等电聚焦法 2、离子交换层析法、离子交换层析法 基质：纤维素、交

8、联葡聚糖、树脂基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂电荷基团：电荷基团：阳离子交换剂阳离子交换剂 （四）（四） 配体亲和力的差异配体亲和力的差异 ： 亲和层析亲和层析 亲和层析作用机理：亲和层析作用机理：(1)(2)(3)absamplewashingelutionxb配体配体xbaa 分离纯化一定数量的游离配体 载体活化 配体与载体偶联activity 亲和层析图谱：elution volumeproteinph 2.05*（五）（五）hplc（high performance/pressure liquid chromatography)hplchplc的特点：的特点：1.1.支持介质颗粒细，比表

9、面积大。支持介质颗粒细，比表面积大。2.2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。hplchplc是一项快速、灵敏、高效的分离技术。是一项快速、灵敏、高效的分离技术。亲和层析纯化胰蛋白酶手脑并用，知行合一 -hn-ch-co-nh-ch-co-hn-ch-co-nh-ch-co-r1r1r2r2chom的理化性质的理化性质（分离纯化的依据）（分离纯化的依据）chom的性质的性质（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）亲和层析纯化胰蛋白酶的效果亲和层析纯化胰蛋白酶的效果依依 据据方方 法法实验内容提要实验内容提要1. 鸡卵类粘蛋白的制

10、备鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白粗品的制备鸡卵类粘蛋白粗品的制备 鸡卵类粘蛋白粗品的精制鸡卵类粘蛋白粗品的精制 2.亲和吸附剂的合成亲和吸附剂的合成 载体的活化载体的活化 配体与载体的偶联配体与载体的偶联 亲和吸附剂的装柱亲和吸附剂的装柱 3. 猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制 猪胰蛋白酶原的提取猪胰蛋白酶原的提取 胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活 上亲和层析柱纯化上亲和层析柱纯化 三大任务三大任务n项注意项注意需要得到的结果需要得到的结果020406080100120140160051015202530* *de-32de-32纤维素离子交换柱层析纤维素离子交

11、换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图分离鸡卵类粘蛋白的层析图02040608010012014016005101520* * 绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图0501001502000510152025ph0.2mol/lna2hpo4/ml0.2mol/lnah2po4/mlph0.2mol/lna2hpo4/ml0.2mol/lnah2po4/ml5.88.092.07.061.039.06.012.387.77.272.028.06.426.573.57.481.019.06.531.568.57.687.013.06.637.562.57.891.58.56

12、.849.051.08.094.75.3磷酸氢二钠磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液磷酸二氢钠缓冲液 （0.2mol/l,ph5.8-8.0） （25）0.2mol/l磷酸氢二钠：磷酸氢二钠：na2hpo412h2o 71.64g/1,000ml0.2mol/l磷酸二氢钠：磷酸二氢钠：nah2po42h2o 31.21g/1,000ml50毫升鸡蛋清毫升鸡蛋清+50毫升毫升10%三氯醋酸三氯醋酸的盐溶液，产生的盐溶液，产生白色沉淀，白色沉淀，ph应为应为3.5。 室温静置室温静置4小时以上，小时以上，3000转转/分分 离心离心10分钟。上清液分钟。上清液用滤纸过滤。用滤纸过滤。ph为为3.5。 缓

13、慢加入缓慢加入3倍体积的预冷丙倍体积的预冷丙酮。在冰浴中静置酮。在冰浴中静置4小时。小时。 2、sephadex g-25凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐 称取称取30克克sephadex g-25，用，用0.02mol/l,ph6.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液室温溶胀室温溶胀24小时。小时。 真 空 脱 气 后 装 柱 ， 用真 空 脱 气 后 装 柱 ， 用0.02mol/l,ph6.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液平衡柱床，直至记录仪绘出平衡柱床，直至记录仪绘出稳定基线。稳定基线。取取20毫升鸡卵类粘蛋白粗提液上柱脱盐（上样量不超过柱床体毫升鸡卵类粘蛋白粗提液上柱脱盐（上样量不超过柱床体积的积的1/6），用），

14、用0.02mol/l,ph6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。1. 鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白的制备称取称取de-32粉粉10克，用克，用150ml 0.5mol/l naoh-0.5mol/l nacl溶液浸泡溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。水洗至中性后，抽去水分。 用用150ml 0.5mol/l hcl 溶液浸泡溶液浸泡20分钟，抽滤，分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。 用用150ml 0.02mol/l,ph6.5的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液浸泡浸泡10分钟，脱气装柱。分钟，脱气装柱

15、。 将脱盐后的鸡卵类粘蛋白粗提液将脱盐后的鸡卵类粘蛋白粗提液上柱上柱，以，以0.02mol/l,ph6.5的磷酸缓冲液洗去杂蛋白。的磷酸缓冲液洗去杂蛋白。用用0.3mol/l nacl-0.02mol/l ph6.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗洗脱，收集第二峰。脱，收集第二峰。将经将经de-32纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析透析袋袋内，用蒸馏水内，用蒸馏水透析透析，直到用，直到用1%硝酸银硝酸银检查检查无氯离子为止。无氯离子为止。 调调ph至至4.0,加加3倍体积的预冷丙酮，冰浴静置倍体积的预冷丙酮，冰浴静置4小小时以上，离心取沉淀，即得鸡卵类粘蛋白纯品。时以上，离心取沉淀

16、，即得鸡卵类粘蛋白纯品。 标准胰蛋白酶比活性的测定 chom粗品/纯品抑制比活性的测定 chom纯品的要求：品质：比活力8,000 baee unit/mg protein数量： 200mg载体载体sepharose 4b的活化的活化称取称取12克（湿重）克（湿重）sepharose 4b 凝胶凝胶，用，用100ml 0.5mol/nacl溶液溶液淋洗，再用蒸馏水洗去淋洗，再用蒸馏水洗去nacl，抽干。，抽干。 加加10ml 2mol/l naoh, 5ml环氧氯丙烷，环氧氯丙烷，5ml乙晴。室温下搅拌活乙晴。室温下搅拌活化化16-20小时。小时。 用蒸馏水洗去未反应得残留试剂，再用用蒸馏水洗

17、去未反应得残留试剂，再用0.1mol/l ph9.5 naco3缓冲缓冲液液洗涤洗涤,处理好待用。处理好待用。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！用用10毫升毫升0.1mol/l ph9.5 naco3缓冲液缓冲液溶解鸡卵类粘蛋白，加入到溶解鸡卵类粘蛋白，加入到活化好得活化好得sepharose 4b凝胶中，室温下，搅拌凝胶中，室温下，搅拌20-24小时。小时。偶联终止后，抽滤。用偶联终止后，抽滤。用0.5mol/nacl溶液洗去未被偶联的鸡卵类粘溶液洗去未被偶联的鸡卵类粘蛋白，再用蒸馏水洗去蛋白，再用蒸馏水洗去nacl。用用0.1mol/l甲酸甲酸-0.5mol/lkcl,ph2.5的溶液洗

18、，破坏残存的环氧基。的溶液洗，破坏残存的环氧基。再用蒸馏水洗至中性。再用蒸馏水洗至中性。用用30毫升亲和柱平衡液浸泡毫升亲和柱平衡液浸泡10分钟，脱气装柱。分钟，脱气装柱。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶原的激活取胰脏取胰脏50克，加克，加150毫升预冷的毫升预冷的乙酸酸化水乙酸酸化水，用，用组织捣碎机组织捣碎机捣碎。捣碎。 匀浆。在匀浆。在5-10提取提取4小时以上。四层纱布过滤。滤液用小时以上。四层纱布过滤。滤液用2.5mol/l h2so4调调ph2.5-3.0。静置。静置2-4小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗提液。提液。 酶

19、原粗提液用酶原粗提液用naoh调节调节ph8.0,加入固体加入固体cacl2使溶液的使溶液的ca+浓度浓度达到达到0.1mol。加加2mg结晶猪胰蛋白酶结晶猪胰蛋白酶，搅匀，于，搅匀，于4冰箱中激活冰箱中激活12-16小时。小时。待酶比活力达到待酶比活力达到800-1000baee/mg停止激活，用停止激活，用2.5mol/l h2so4调调ph2.5-3.0，滤去，滤去caso4沉淀物，备用。沉淀物，备用。不要忘记测定和计算！不要忘记测定和计算！亲和吸附剂装柱亲和吸附剂装柱上样上样洗脱洗脱亲和层析纯化胰蛋白酶不要忘记测定和计算！不要忘记测定和计算！ 品名 价格sepharose 4b 410

20、0元元/1ldeae-32 cellulose 2600元元/100gsephadex g-25 1800元元/100gacetone 讲授实验原理及操作讲授实验原理及操作 清洗用具、配制试剂（注意贴好标签）清洗用具、配制试剂（注意贴好标签） 提取提取chom(做到丙酮沉淀做到丙酮沉淀chom，过夜），过夜） 溶胀溶胀sephadex g-25 （干粉）（干粉） sephadex g-25洗涤装柱（已溶胀）洗涤装柱（已溶胀） 处理处理deae-32纤维素并装柱纤维素并装柱 测定标准胰蛋白酶活性测定标准胰蛋白酶活性第一天第一天理顺思路！要做什么？怎么做？理顺思路！要做什么？怎么做？第二天第二天离心收集离心收集chom sephadex g-25装柱（溶胀装柱（溶胀24小时后）小时后）用用sephadex g-25脱盐脱盐提取第二份和提取第二份和第三份第三份chom deae-32离子交换层析纯化离子交换层析纯化chom透析透析测定测定chom的抑制活力的抑制活力（要求：数量：（要