临床基因扩增检验实验室管理暂行办法1

1、临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 1第一章 总 则第一条 为规范临床基因扩增检验实验室治理，保证临床基因扩增检验质 量，使临床诊断和治疗更为科学、合理，特制定本方法。第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测 DNA或RNA为方法的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（L CR）、转录依靠的放大系统（TAS）自主序列复制系统（3SR）和链替代扩 增（SDA）等。第三条 本方法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验 实验室设置在二级以上医院。第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督治理局批准的 临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。第五

2、条 卫生部临床检验中心（以下简称卫生部临检中心）和省、自治区、 直辖市临床检验中心（以下简称省临检中心）负责对所辖行政区域内临床 基因扩增检验实验室的质量监督治理工作。第二章 实验室设置和验收第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照临床基因扩增检 验实验室差不多设置标准 （见附件）筹建实验室；筹建完成后，由法定代 表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料：（一）医疗机构执业许可证复印件；（二）可行性研究报告；1、拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机 构的差不多情形、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运 行的推测分析；2、拟设临床基

3、因扩增检验实验室的设置平面图；3、拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有 关技术人员资料第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织有关专业的专家组（以下简 称专家组），按照临床基因扩增检验实验室差不多设置标准对提出申请 的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后，在 20 日内将验收 报告寄送至申请机构。第八条 经专家组技术验收合格的医疗机构将本方法第六条规定的材料及 专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级 卫生行政部门后 15 日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见，方可开展 专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。第九条 未经专家组验

4、收合格并报省级卫生行政部门备案的医疗机构不得 擅自开展临床基因扩增检验项目。第三章 实验室监督治理第十条 临床基因检验实验室必须按照临床基因扩增检验实验室工作规 范（另发）开展临床基因扩增检验工作。第十一条 临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合 格者，由培训单位发给合格证书，并将培训合格人员名单报卫生部临检中 心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。 培训单位为卫生部临检中心，或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检 中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。第十二条 以科研为目的的基因扩增检验项目。不得向临床出具检验报告， 不得向病人收取任何费用。第十三条

5、临床基因扩增检验实验室必须按照临床基因扩增实验室工作规 范开展室内质量操纵，并参加卫生部临检中心组织的室内质量评判。第十四条 卫生部临检中心按照本方法和临床基因扩增实验室工作规范 和谐、组织省临检中心对临床基因扩增检验实验室的检验质量进行监测。 监测结果报省级卫生行政部门，同时抄送被监测的临床基因扩增检验实验 室所在医疗机构。第十五条 卫生部临检中心或省级临检中心受省级以上卫生行政部门托付 可对临床基因扩增检验实验室进行现场检查，现场检查工作人员在履行职 责时应出示证件。在进行现场检查时，检查人员有权调阅有关资料，被检 查机构不得拒绝或隐瞒。第十六条 卫生部临检中心对在室间质量评判中不合格的临

6、床基因扩增检 验实验室提出警告，对连续一次或二次中有一次发觉临床基因扩增检验结 果不合格的临床基因扩增检验实验室，卫生部临检中心报省级以上卫生行 政部门由省级以上卫生行政部门责令其暂停有关临床基因扩增检验项目， 限期整改。经专家组进行再次技术验收并合格，并报省级卫生行政部门核 准后，方可重新开展临床基因扩增检验项目。第十七条关于未经卫生部临检中心组织的专家组技术验收合格并报省级 卫生部门备案，擅自开展临床基因检验项目的医疗机构，由省级卫生行政 部门依据医疗机构治理条例第四十七条和医疗机构治理条例实施细 则第八十条予以处罚，并予以公告。公告所需费用由被公告机构支付。第十八条 显现下列情形之一的临

7、床基因扩增检验实验室，由省级卫生行政 部门责令其停止开展临床基因扩增检验，并对其所在医疗机构予以公告。 公告所需费用由被公告机构支付：（一）开展超出卫生部临检中心组织的技术验收合格并报省级卫生行政部 门备案 临床基因扩增检验项目的；（二）使用未经国家药品监督治理局批准的试剂开展临床基因扩增检验 的；（二）在临床基因扩增检验中未开展室内质量操纵的；（四）在临床基因扩增检验中未参加室间质量评判的；（五）在临床基因扩增检验中弄虚作假的；（六）以科研为目的的基因扩增检验项目向病人收取费用的；（七）使用未经培训合格的专业技术人员从事临床基因扩增检验的； 第四章附则第十九条对采供血机构的基因扩增检验实验室

8、开展基因扩增检验项目的 治理，参照本方法执行。第二十条 卫生部临检中心组织的专家组对申请开展临床基因扩增检验的 实验室进行技术验收所需费用按国家有关规定执行。第二一条本方法由卫生部负责讲明。第二十二条 本方法自公布之日起施行。附：临床基因扩增检验实验室差不多设置标准 按照临床检验扩增检验实验室治理暂行方法 ，制定本标准 一、 临床基因扩增检验实验室区域设置原则 （一） 临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和预备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区 如使用全自动分析仪，区域可适当合并。（二） 各工作区域必须有明确的标记，幸免不同工作区域内的设备、物品 混用。

9、（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和预备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区。（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色） 。工作人员 离开各工作区域时，不得将工作服带出。二、 工作区域仪器设备配置标准（一） 试剂储存和预备区1、2-8C 和-15C 冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖 1-1000ul）4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸 头（带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二） 标本制备区1 、 2-8C 冰箱、 -20C 或 -80C 冰箱2、高速台式冷冻离心机

10、3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器（覆盖 1-1000ul）6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸 头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子 DNA ，应具有超声波水浴仪。（三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖 1-1000ul）3、可移动紫外灯（近工作台面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器 吸头（带滤心）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品（四）扩增产物分析区视检验方法不同而定。差不多仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖 1-

11、1000ul）2、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品如何迎接临床基因扩增检验实验室技术验收 2003年华东区临床检验中心协作组临床实验室质量治理及新技术应 用高级研讨会临床基因扩增检验实验室要紧应用把 PCR (聚合酶链反应)技术应用 于疾病的诊断与治疗监测。PCR技术发明是生物医学领域的一项革命性创 举，具有深远历史意义，但在上世纪九十年代中国，在我国由于部分医部 机构受利益的驱动，在缺乏技术、设备以及规范化治理的情形下，PCR技术临床应用泛滥，显现大量假阳性和假阴性结果，甚至显现虚假检测报告， 造成检验

12、结果和临床意义应用十分纷乱，严峻扰乱正常医疗秩序，专门在 性病基因检测方面，甚至还带来一系列道德伦理、家庭纠纷以及社会和法 律咨询题。PCR技术临床应用所显现的一系列咨询题引起卫生部治理层高 度重视，卫生部医政司于1988年下发了卫医发19989号文件宣布PCR技 术暂停应用于临床诊断。通过近四年反复论证，卫生部2002年 1 月 14日公布“临床基因扩增检验实验室治理暂行方法” ，同年 2月 20日卫生部临 床检验中心公布“临床基因扩增实验室工作规范” 。两个文件宣布了 PCR 技术临床应用解冻，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的差不多条件：规范的 PCR实验室编写适合本

13、实验室的质量手册 经PCR专业知识培训的技术人员(PCR上岗证)使用有生产批文的 P CR 试剂。具备条件的二级以上医院可向卫生部或省临床检验中心申请技术 验收。质量治理的历史1950年代临床实验室开始质量操纵( Quality Control,QC ) ;1980年代 参照工业的 GMP 治理思路建立良好实验室实践准则( Good Laboratory Pr actice,GLP);进入质量保证(Quality assurance,QA ; 1990年代实验室引入 质量体系认证及实验室认可制度，实现全面质量治理( TQM ， Total Qualit y Managemen)。质量体系认证

14、IS09000( 2000版)；实验室认可 I SO/IEC 标准 17025-2000校准和检测实验室资格的通用要求 ; ISO/DIS 标 准 15189-1999“医学实验室的质量治理。 ”2 美国临床实验室认证? 发证机构： HCFA( Health Gare Financing Administrations) ,卫生保健署 ? 认证依据， CLOA38 ，行业认可，强制，体系 +能力? 认证中介机构：*JCAHO ( Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations) 卫生气构认可联合委员会*CAP(Coll

15、ege of American Pathologist)美国病理家学会*COLA ( Commission on Office Laboratory Accreditation)大夫实验室认可委员会3 我国实验室合格评定? 认可*依据： ISO/IEC 17025，15189* 国家评审，自愿，体系 +能力? 认证*依据： ISO 9000：2000版*中介机构，自愿，体系? 行业技术验收*临床实验室治理方法 ，江苏省医院检验科建设与治理规范* 省、市临床检验中心，强制，体系 +能力4 PCR 验收意义及验收依据2002年开始的PCR实验室验收工作开创临床检验技术准入的先河、推动临床实验室标准

16、化建设、规范检测市场、建立医疗事故预防机制。其 依据为：临床基因扩增检验实验室治理暂行方法卫医发 200210 号临床基因扩增检验实验室工作规范卫检字 20028 号关于成立临床基因扩增检验专家组的通知苏卫医 200242 号5 规定应具有的 SOP( 13 个) 仪器设备的爱护保养程序、仪器设备的校准程序、仪器设备的操作程 序、临床标本收集程序、临床标本的处理(核酸纯化)程序、临床标本的 储存程序、试剂的质检操作程序、消耗品购置验收和储存程序、废弃物的 处理程序、内务治理程序、室内质量操纵程序、核酸扩增及产物分析检测的操作程序、埋怨处理程序。6 质量治理体系6.1 定义 在质量方面指挥和操纵

17、组织的治理体系。 （Quality Manageme nt System）治理体系是指建立方针和目标并实现这些目标的体系。实验室 通过把组织机构、职责、工作程序、质量活动过程和各类资源、信息等和 谐统一起来所形成的有机整体即为实验室的质量体系。6.2 质量体系的文件构成 第一层：质量手册（纲领性文件） ；第二层：程 序性文件（体系要素的规定） ；第三层：作业指导书（具体项目的操作指导） ； 第四层：记录包括表格、签名、原始记录、报告等质量记录和技术记录。6.3 质量手册定义GB/T6583 定义：质量手册是阐明一个实验室的质量方针，并描述 质量体系的文件。它既是质量体系的表征形式，又是质量体系

18、建立和运行 的纲领。它对实验室的组织结构（含职责） 、程序、活动能力（过程）和资 源作出规定，是实验室长期遵循的文件。6.4 质量手册的分类按照手册的内容和用途分为二类：质量保证手册用于证明，供 客户使用，质量治理手册用于运行，供实验室内部使用。6.5 质量手册的作用编写质量手册的健全和完善质量体系的首要环节。按照实验室的内 外因素合理调整、选择体系要素，分配和落实质量职责，理顺治理关系， 明确治理责任，合理安排各类文件的层次，把实验室积存的体会变成法规 性文件。和谐各工作环节的准则。内部质量审核的依据；对外证实实验室的质量保证能力，提升客户 的信任度。6.6 质量手册的特点? 以客户为关注焦

19、点：以病人为中心，为临床服务? 领导作用：制造使职员能够充分参与实现目标的环境? 全员参与：各负其责? 过程方法：将资源和活动作为过程进行有效治理? 治理的系统方法：各个过程的有效连接? 连续改进：按照实际持续完善? 基于事实的决策方法：遵循科学，实事求是出报告? 与供方互利的关系：相互协作，共同获利6.7 质量手册的结构? 封面? 批准页：包括实验室名称、标志，发行版次，生效日期，批准人签名， 手册编号，受控状态。? 实验室公平性声明? 修订页：以表格描述修订序号、修订的章节条款和简要内容、批准人及 日期。? 名目：各章节条款的名称及页码? 前言：介绍实验室的一样情形和手册的适用范畴以及手册

20、中术语或缩略 语的定义? 手册的治理：对手册的储存、分发、评审、修订以及保密作出规定? 质量方针及目标? 组织结构及人员责权益关系? 要素描述：由系列 SOP 文件对溯源、人、机、料、样、法、测等质量诸 要素的陈述? 支持性文件：包括实验室平面图、人员一览表、仪器设备一览表、引用 标准及参考文献等6.8 标准操作程序Standard Operational Procedure简称SOP。程序的定义为：为进行某项活动 所规定的途径。SOP是临床实验室内部以文件的形式对质量活动用规定的 方法进行连续而恰当的操纵。实验室的SOP应涵盖所有的质量活动，包括检测或校准打算、治理性程序、技术性程序、项目操

21、作程序和记录表格等。 由于阻碍每个实验室的质量活动的条件和因素不一样，一个SOP只在某个实验室内有效，而不一定适用于其他实验室。6.9 标准操作程序的一样要求? 对完成各项质量活动的方法作出规定，每个 SOP 都应对一个或一组相互 关系的活动进行描述；? 每个 SOP 应讲明该项质量各环节的输入、 转换和输出所需的文件、 物资、 人员、记录以及它们与有关活动的接口关系；? 规定开展质量活动的各个环节的物资、人员、信息和环境等方面应具备 的条件；? 明确每个环节转换过程中各项因素的要求，即由谁做、做什么、做到什 么程序、达到什么要求，如何操纵、形成什么记录和报告，以及相应的审 批手续；? 规定在

22、质量活动中需要注意的例外或专门情形的纠正措施；? SOP 应简练、明确和易懂同时工作人员熟练把握和严格遵守。6.10 举荐 PCR 实验室质量手册名目1. 质量方针和宗旨2. 工作制度2.1 实验室的设置、布局及组织结构2.2 实验室内务治理制度2.3 实验室的人员配置及治理制度2.4 生物防护与安全制度2.5 实验室废弃物处理制度2.6 实验室清洁消毒制度2.7 仪器设备的治理制度2.8 仪器、试剂、耗材购置程序及治理制度2.9 临床标本的治理制度2.10 实验室记录的治理制度2.11 质量操纵工作治理制度2.12 结果报告治理制度2.13 岗位责任制2.14 埋怨制度3. 操作指导书（ S

23、OP）3.1 消毒标准操作程序3.2 超净工作台使用标准操作程序3.3 超净工作台爱护和保养标准操作程序3.4 PCR 仪使用标准操作程序3.5 PCR 仪爱护和保养标准操作程序3.6 台式离心机使用标准操作程序3.7 高速冷冻离心操作标准操作程序3.8 移液器使用标准操作程序3.9 加样器校准标准操作程序3.10 冰箱爱护和保养标准操作程序3.11 电热恒温水浴箱操作程序3.12 电子天平使用和校正操作程序3.13 可移动紫外消毒车使用操作程序3.14 温度计校准程序3.15 试剂的质检操作程序3.16 标本唯独标识编号编制规则3.17 临床标本的采集及处理操作程序3.18 临床标本的储存程

24、序3.19 乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序3.20 室内质量操纵标准操作程序3.21 室间质评标准操作程序4. 引用图表4.1 实验室组织结构图4.2 实验室工作人员一览表4.3 人员培训打算及培训记录表4.4 要紧仪器设备一览表4.5 临床送检标本流程图4.6 PCR 扩增可同意标本记录表4.7 PCR 扩增拒收标本记录表4.8室内质控结果记录表4.9室间质控记录表4.10消耗性材料验收记录表4.11试剂验收记录表4.12故障处理表4.13仪器设备使用记录表4.14仪器设备爱护保养记录表4.15实验室清洁消毒记录表4.16工作区温度、湿度记录表4.17埋怨记录表4.18标本超低温储存记

25、录表4.19应急处理记录表4.20垃圾处理记录表4.21冰箱温度记录表4.22水浴箱温度记录表4.23移动紫外消毒车记录表4.24设备校正记录表4.25检测结果报告流程4.26报告单样张6.11文件格式一目的二范畴三职责四工作流程五引用文件及表格6.12写作技巧? 目的： WHY ，什么原因要开展这项活动? 范畴： WHAT ，活动涉及的方面? 职责： WHO+WHAT ，谁做，谁负责? 工作流程：列出活动顺序和细节， 明确各环节“输入转换输出” ， 即做何事（WHAT）、何人做（WHO）、何时做（WHEN ）、何地做（WHE RE）、如何做（HOW）? 引用文件和表格： 开展此项活动涉及的文

26、件、标准以及使用的表格、证明文件和记录储存期7 评审中常见咨询题7.1 手册 文件不全，无系统性；质量要素描述不全；格式不对；与实际工作 脱节；无现行有效性（无手签，各区无相应手册） ；记录不全、不规范7.2 人员人员档案：每人一个档案袋，有关资格证书（如上岗证） 、培训、 技能和经历等。培训打算及实施记录：每人有年度、季度、月的培训内容及实施记录；内 容包括外出学习、进修，内部质量手册学习、业务学习、新项目引进等。7.3 设施与环境通风、紫外、清洁、消毒的程序及记录、生物安全防护的程序及记 录、生物垃圾的处理。7.4 仪器设备 采购程序及验收标准；校准程序及状态标识，使用、爱护、保养的 程序

27、及记录；档案：每个与检测质量有关的设备均应建档，内容包括：设 备的名称；制造商名称、型号、序号或其它唯独性标识；接收日期和启用 日期；）目前放置地点；接收时的状态（例如全新的、经改装的） ；仪器使 用讲明书或其复印件； 校准和 /或检测的日期和结果以及下次校准和 /或检测 的日期；迄今所进行的爱护和今后爱护打算的细节；损坏、故障、改装或 修理的历史。7.4 料（试剂、耗品） 采购程序及领用记录，质检标准、程序及记录，应急程序；缺货、 试剂变质；室内质控品。7.5 样（品）标本唯独编号，年月日项目顺序号；标本采集标准操作程序；标本 同意（拒收）标准、交接记录；标本储存、销毁的程序及记录；标本处理

28、 标准操作程序7.6 （方）法 方法学的有效性依据； SOP 的合理性生搬硬套；分区操作 的协作流程合理；质控点的安排提取效率、扩增效率；基线的调 整一一CT值、本底荧光值。7.7 （检）测?室内质控的SOP:耗品质检，试剂质检，质控方法（纠错措施），质控图 ?室间质评的SOP:纠偏措施7.8 报告? 发放范畴:门诊、病区、外单位? 发放方式:保密、电子、邮件? 报告单的格式:唯独编号、检测下限、实验室申明? 审核、标准、不合格报告的处理7.9 埋怨? 实验室服务、质量改进的依据? 对象:病人、大夫、工作人员。 SOP 应明确方式、职责、反馈、记录。临床基因扩增检验实验室治理暂行方法如何迎接临

29、床基因扩增检验实验室技术验收设计与验收标准临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊 断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其治理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见临床基因扩增检验实验室治 理暂行方法 （卫医发200210 号文）附件临床基因扩增检验实验室差不多 设置标准。为幸免污染，必须严格遵循临床基因扩增检验实验室设置标 准设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪 器设备。各区域都必须有明确的标记，以幸免设备物品如加样器或试剂等 从其各自的区域

30、内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进 入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和预备区、 标本制备区、 扩增反应混合物配制和扩增区 （简称扩增区 ）至产物分析区， 幸 免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的 工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的 工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个要紧缘故，因此实验室的清洁应按试剂 贮存和预备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自 的清洁用具以防止交叉污染。（一）试剂贮存和预备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制 备。贮存试剂

31、和用于标本制备的材料应直截了当运送至试剂贮存和预备区，不 能通过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快 速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮 存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，幸免由于 经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩 增的试剂都应冰冻贮存。为幸免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂， 应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积按照通常在实验室内一次 测定所需的扩增反应数来决定。 主反应混合液的组成成份专门是聚合酶的适用性和稳固性通过预试验来检 查，评判结果必须有

32、书面报告。关于 "热启动 "技术（在第一个高温变性步骤 后加入酶 ），聚合酶也可不包含在主反应混合液中。 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外， 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。 工作终止后必须赶忙对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受 诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照耀应方便 有效。由于紫外照耀的距离和能量对去污染的成效专门关键，因此可使用 可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上 6090cm内照耀。 由于扩增产物仅几百bp,对紫

33、外线损害不敏锐，因此紫外照耀扩增片段必 须延长照耀时刻，最好是照耀过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记 录。（二）标本制备区下述操作在该区进行：临床标本的储存，核酸 （RNA、DNA）提取、贮存及 其加入至扩增反应管和测定 RNA 时 cDNA 的合成。要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发动气溶胶所致的污染,因 此应幸免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设置正压条件幸免从邻 近区进入本区的气溶胶污染。为幸免样本间的交叉污染,加入待测核酸后, 必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料,必须有 明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒 （例如含次氯酸钠

34、溶液 ）容器内。实验 室桌椅表面每次工作后都要清洁,实验材料 （原始血标本、血清标本、提取 中的标本与试剂的混合液等 ）如显现外溅,则必须分别处理并作出记录。对实验台适当的紫外照耀（254nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污 染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照耀。样本处理对核酸扩增有专门大阻碍，必须使用有效的核酸提取方法，可在 开展临床标本检测前对提取方法进行评判。用于 RNA 扩增检测的样本制备好以后，应赶忙进行 cDNA 合成，因为 cD NA 链较 RNA 稳固，储存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本 制备区设置一个以上的温育装置。cDNA 合成的理想温

35、度依所使用的酶而定， 倾向于使用一步法： 即使用在扩 增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳固的 DNA 聚合酶进行逆转录， 其较 cDNA 合成后再开盖以调剂缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的 可能性降低。待测 RNA 的 cDNA 拷贝须储存在标本制备区，不得在本区对样本进行 PC R 扩增。（三）扩增区下述工作在本区内进行： DNA 或 cDNA 扩增。此外，已制备的 DNA 模板 和合成的 cDNA（ 来自样本制备区 ）的加入和主反应混合液 （来自试剂贮存和 制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，通常 在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染

36、危险性，第 二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进入任何 "上游 "区域，可降低本区的气压以幸免气溶胶从本区 漏出。为幸免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在 超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，专门是 在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。 可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适 合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但 必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种连续性的污染源。用过的加样 器必须注意清洁消毒。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁

37、和消毒，紫外照耀方 法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。（四）扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。 核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法 （同 位素标记或非同位素标记 ）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Sout hern转移、核酸测序方法等。目前国内的商品试剂盒绝大部分均采纳非同 位素标记的微孔板上探针杂交方法，即 PCR-ELISA 方法，也有膜上探针杂 交方法。本区是最要紧的扩增产物污染来源，因此必须注意幸免通过本区的物品及 工作服将扩增产物带出。在使用 PCR-ELISA 方法检测扩增产物时，必须使 用洗板机洗板，废液必须

38、收集至 1mol/L HC1 中，同时不能在实验室内倾倒， 而应至远离 PCR 实验室的地点弃掉。用过的吸头也必须放至 1mol/L HCl 中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰 胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。本区的清洁消毒和紫外照耀方法同前面区域。本区如采纳负压条件或减压 情形下（如安装排风扇 ）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。二、临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有时期， 即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及 测

39、定后的结果报告等。（一）标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括 EDTA 或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、 血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次 性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和 骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必 须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的 RNA 酶。 最好是热灭菌，250C烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。 EDTA 和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。 不 能使用肝素抗凝，因为肝素是 Taq 酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取

40、步骤中专门难去除。临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽 快（3小时以内）分离血浆，以幸免 RNA 的降解。如未作抗凝处理，则抽血 后，必须在 1 小时内分离血清。（二）标本的稳固化处理用于 DNA 扩增检测的标本， 采集后一样不需要专门的稳固化处理， 但标本 应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳 固化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐 （Guanidine thiocyan ate,GITC）可使DNA酶和RNA酶赶忙失活，因此在采集标本时，可将标本 材料如血清或血浆按 1:4 的比例加至含有 5m

41、ol/L GITC 的试管中，从而使 血清（浆）中的 RNA 酶不可逆失活。经上述稳固化处理后，标本一样不需要 冷藏即可邮寄。关于特定的检测项目，上述稳固化处理方法的成效怎么讲 如何，要使用相应的逆转录 PCR测定方法来评判。（三）标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。通过适当稳固化处理的标本可在常温下 通过邮寄运送。如用于 DNA 扩增检测的 EDTA 抗凝全血标本及用于 RNA 扩增检测的经 GITC 稳固化处理的标本。 通常在运送时， 应采纳不易破裂的 容器装载标本。用于 RNA 检测的标本，如果未经稳固化处理，则必须速冻 后，放在干冰中运送。（四）标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等

42、可于-70C下长时刻贮存。用于DNA测定的已 纯化核酸样本可在 10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA 缓冲液 （pH 7.5-8.0）中 4C储存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80 C或液氮中贮 存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20C即可。用GITC处理的RNA标本在 室温可储存 7 天。（五）标本的处理 （核酸提取 ）标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品 核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评判以验证 其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致， 抑制物可能来源于标本本身 （如血红素及其前体

43、或降解产物 ）或核酸提取过 程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）,这些物质对其后的Taq酶扩增反应步 骤具有强烈的抑制作用，从而阻碍靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则 必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化 时刻不能过长。此外，当靶核酸为 RNA时，逆转录PCR测定失败的常见 缘故是标本在运送前未经充分的稳固化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。关于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发觉有 RNA 降解的证据， 实验室则应拒绝同意标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指 导。关于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增1、靶 RN

44、A 的逆转录cDNA 合成为逆转录 PCR 中的第一个酶反应步骤，所产生的 cDNA 为靶 R NA 的反向互补链， 为后面扩增的模板。 下述因素通常阻碍 cDNA 合成的效 率：（1）逆转录效率的降低或完全缺乏。 其可能的缘故有逆转录酶质量不高、 试剂降解变质或加样错误等； （2）用于逆转录的标本中存在逆转录或 Taq 酶 的抑制物 （如酚、氯仿、血红素等 ）；（3）RNA 酶的存在导致 RNA 的降解。2、核酸的扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中 抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试 剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极

45、为重要，必须定期对扩增仪的 温度操纵和加热模块中热传导的一致性进行检查，以幸免假阴性结果。（七）污染在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染 （产物污染 ）；天 然基因组 DNA 的污染、试剂污染（贮存液或工作液 ）以及标本间交叉污染 （如 气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本 ）。临床基因扩增检验实验室 中污染的最要紧来源是扩增产物的污染。由于一旦发生污染后，再围绕实验室来查找污染源不仅耗时而且还专门繁 琐，因此防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到 发觉了污染源为止，同时实验结果必须作废。1、测定分析前的污染源 测定分析前实验材料的污染要紧来自非病人标本来

46、源的核酸。2、测定分析时期的污染源 通常，测定分析时期的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任 何成分及核酸的制备和反应建立时期所涉及到的实验设备的任何部位差不 多上可能的污染源。如受污染的试剂 （例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油 ）、 商品酶制剂、消耗品 （如反应管，吸头 ）和实验设备 （如加样器、离心机 ）等。 在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实 验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，专门容易 引起污染，因此必须制定标准操作程序（SOP），并严格执行。3、污染的幸免 要幸免污染，第一应是预防而不是排除污染，前面所述对工作区的严格划 分的目

47、的即是为了预防污染。为幸免往常测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩 增反应中用dUTP取代部分dTTP,使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶， 如此扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖苷酶 （UNG），可破坏来自往常测定 的扩增产物，从而幸免其对以后要进行的扩增测定的污染。另外一种方法 是连续的长波紫外灯照耀， 通过异补骨脂素光化学产生 DNA 加合物， 由于 DNA加合物对扩增没有反应但又不阻碍 PCR后杂交过程，因此这种方法也 能防止污染。上述防污染方法只在一定程度上有效，因此不能用其来替代严格的实验室 设置和治理，专门是这些方法不能防止外来非扩增的天然 DNA 的污染。4、去除

48、污染的措施 工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳成效。去污染措施包括但不仅限下面几种： （1）用10%（v/v）次氯 酸钠清洁表面； （2）试验后长时刻的紫外照耀实验操作台面和其他表面； （3） 实验设备如加样器的高压消毒。（八）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、 测序、分光光度法定量等，但临床 PCR检验项目差不多上都使用探针杂交 方法。 杂交结果不充分的缘故可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的 标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。最常使用的基因探针有： DNA 片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义 R

49、 NA 探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。 在扩增后的杂交检测中 , 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交 条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号 的特异性带来负面阻碍。相反，提升温度和 /或降低离子强度会增加杂交的 严格性。因此，严密操纵温度和试剂的离子强度是幸免假阳性和假阴性结 果的先决条件。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。（九）质量操纵质量操纵包括两个方面，即室内质量操纵 （以下简称质控 ）和室间质量评判。1、室内质量操纵必须对 DNA 和 RNA 分析的各步进行质量操纵，以幸免假阳性和假阴性， 保证测定结果的准确性和重复

50、性。由于核酸扩增测定的高敏锐性，因此标 本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。（1）标本制备： 常用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA 提取成效，以判定所提取 的 DNA 是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的 DNA 的平均长度一 样为100kb,用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范畴 为30-40kb。明显显现降解的 DNA（在1和10kb的低分子量范畴内）在经琼 脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化 不敏锐的限制性内切酶（如EcoRI）消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性 的抑制剂进行质控 （在抑制剂存在的情形下， 高分子量的片段不被酶切 ）。潜 在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光