分子瘤学基础

1、毒理学教研室 徐德祥l肿瘤发病的流行病学现状l肿瘤发病机制的研究进展l肿瘤的分子诊断研究进展1、恶性肿瘤发病和死亡率明显升高，成为人类死因的第一位（城市）或第二位（全国）；2、恶性肿瘤的发病顺位发生了明显的变化。 生活方式改变 环境改变1、肿瘤的多因素多阶段多基因参与的过程 2、肿瘤的发病与体细胞突变有关3、信号传导与肿瘤4、细胞周期与肿瘤5、细胞分化与肿瘤6、细胞凋亡与肿瘤7、肿瘤的遗传易感性l多因素l多阶段： 二阶段学说 多阶段学说l多基因参与： 癌基因、抑癌基因 细胞凋亡相关基因、肿瘤易感基因l癌基因：维持细胞正常生理功能所必须的基因 细胞增殖、分化、信号转到l体细胞突变学说：肿瘤的发生

2、与癌基因突变有关 点突变、dna扩增 染色体重排、甲基化l抑癌基因：纯合缺失或失活而引起恶性转化的基因l二次突变学说（rb基因，视网膜母细胞瘤） 遗传性视网膜母细胞瘤患者（rb等位基因突变或缺失）： 一次突变引起发病 非遗传性视网膜母细胞瘤： 二次突变突变引起发病l肿瘤易感性：环境与遗传l肿瘤易感基因： 癌基因和抑癌基因的突变 dna修复缺陷 代谢酶基因：化学致癌1、 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 肿瘤的分子诊断涉及到各种恶性肿瘤及癌前病变，主要集中在各种癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、rna、dna水平进行判断，为肿瘤的基础研究、肿瘤防治和

3、个体化或预见性治疗提供更详尽的证据。（1） 肿瘤易感基因的检测肿瘤易感基因的检测 （2） 肿瘤的分类肿瘤的分类 对bcr区基因重排检测：可诊断慢粒并与急粒鉴别。 神经母细胞瘤n-myc明显扩增和过表达； 神经上皮瘤c-myc扩增和过表达。 （3） 肿瘤的早期诊断肿瘤的早期诊断 （4） 肿瘤的预后判断肿瘤的预后判断：从分子水平上判断肿瘤的良、恶性及预后，有较高的准确性。肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等常与预后密切相关。 （5） 肿瘤的个体化和预见性治疗肿瘤的个体化和预见性治疗:肿瘤的发生是多基因、多步骤、多阶段的过程，在发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式，而基因的变化和基

4、因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关。提供肿瘤基因变化，对治疗有指导意义。 （6） 肿瘤的预后监测肿瘤的预后监测 （1） 基因过表达的形式基因过表达的形式l 癌基因激活和抑癌基因失活，是肿瘤发生过程中的关键因素。l 癌基因产物过表达是癌基因激活的重要表现形式之一。癌基因一般为单拷贝基因，在肿瘤细胞内的一些癌基因在dna复制过程中扩增，常导致基因产物过表达，表现为mrna和蛋白质量增加。l 有些抑癌基因突变后可起到癌基因的作用（如p53基因），产生突变型蛋白。 （2）基因过表达的检测）基因过表达的检测 表达产物的检测：表达产物的检测：几乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有相应抗体，其中大多

5、数已商品化。l 免疫组化免疫组化（immunohistochemistry）l 酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（elisa）l 免疫沉淀法免疫沉淀法：检测并定量分析蛋白质混合物中的靶抗原敏感（可检出100pg的放射性标记蛋白）。与sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳并用，可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达。l蛋白印迹法（蛋白印迹法（western blot）：）：70年代末80年代初，在蛋白质凝胶电泳（分辨率高）和固相免疫测定（特异敏感）的基础上发展的，结合了二者优点，无需同位素标记，具有从混杂抗原中检出特定抗原，或从多克隆抗体中检出单克隆抗体的优势，还可对转移到固相膜上的蛋白进行连续分

6、析，有蛋白质反应均一性、固相膜保存时间长等优点。敏感性为15ng。 细胞裂解sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质电转移封闭加一抗加二抗显色照像。l流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytometryflow cytometry）测试法：）测试法：用荧光标记抗体与含有特异抗原的细胞结合，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞分类测试，可检测细胞表面受体、标志物或特异性蛋白及细胞的分类分析。基因扩增的检测：基因扩增的检测：肿瘤基因扩增可产生过量的表达蛋白，也可表现为基因拷贝数增加和转录产物mrna增加。 经典检测方法为核酸分子杂交，包括原位杂交（in situ hydridization，ish）、荧光原

7、位杂交（fish）、dna杂交（southern blot）、rna杂交（northern blot）、原位pcr、逆转录pcr（reverse transcription pcr，rt-pcr）。lfish 将荧光素标记克隆的dna片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定特定的dna片段是否有缺失或扩增。 l原位原位pcr：结合了pcr与ish技术优点，在组织切片或细胞涂片上原位对特定dna或rna进行扩增，再用特异性探针作原位杂交检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。 l逆转录逆转录pcr（rt-pcr） 用来扩增从rna分子中得到的一段特异序列。rna首先被逆转录为cdna。用

8、位于一段特异序列或一个基因两侧的引物生成以cdna为模板的pcr产物，得到阳性产物说明存在特异性的rna序列。为扩增从mrna逆转录的cdna，引物中应含一段目的基因的内含子区，以使从带有基因组dna的pcr产物中区分出cdna的pcr产物。经典方法包括rt和pcr两步。 （3）肿瘤基因差异表达的检测）肿瘤基因差异表达的检测 控制生物性状的基本结构和功能单位是基因，不同细胞或同一细胞的不同时间与空间基因表达的差异决定着生命活动的多样性，如发育、分化、繁殖、细胞周期调控、衰老、死亡等。实际上，细胞的各种生理过程或病理改变本质上都是由基因表达的改变所决定的。因此获取差异表达的基因将有助于了解正常生

9、理变化和病理改变的分子机制，为基因诊断、基因治疗和发现新的药物靶分子提供新的视野。 dd-pcr（differential display pcr）又称差异显示反转录pcr（ddrt-pcr） 简要流程简要流程 对照组 处理组 反转录 mrna或总rna mrna或总rna pcr. cdna cdna 扩增产物 扩增产物 电泳分离 比较 回收差异显示带 pcr 克隆、杂交、测序 与genbank数据库中的已知序列进行同源性匹配 确定相关基因 rsdd（交互式差减差异rna显示，reciprocal subtraction differential rna display）：dd-pcr中采用

10、差减过的rna或cdna样品。1998年kang等，分析了腺病毒转化的大鼠胚胎细胞株e11和获得侵袭性致癌表型的e11-nmt细胞株间的差异表达基因。 e11 cdna文库 e11-nmt cdna文库 交互式差减e11减e11-nmt差减 cdna文库 e11-nmt减e11差减 cdna文库 体内切割 以锚定引物和5随机引物pcr扩增 显示 5%测序胶显示并分离差异条带 再扩增，反向northern分析 northern blot 分析 表达分析 克隆并测序，northern blot确证（4）基因突变的检测基因突变的检测 pcr-sscp法法（pcr-single strand conf

11、ormational polymorphism，聚合酶链反应单链构象多态分析）：单链dna在中性条件下会形成二级结构，即使有一个碱基不同，也会形成不同的二级结构而出现不同的迁移率。靶dna或rna经pcr扩增后，产物变性处理，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（page），靶dna或rna中含有单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化就出现泳动变位，从而检测出含有基因突变的dna或rna片段。 杂合双链分析法杂合双链分析法（heteroduplex analysis，ha）：由突变型和野生型dna形成的异源杂合双链在其错配处会形成突起，在非变性胶中电泳时，会产生与相应的同源双链dn

12、a不同的迁移率。 突变体富集突变体富集pcr法法（mutant-enriched pcr）：利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在的已知限制性内切酶位点，用连续2次巢式pcr对包括酶切位点的dna片段进行扩增，在2次pcr之间用相应的内切酶消化扩增产物，野生型因酶切不能进入第2次pcr，而突变型则能完整进入第2次pcr并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis，dgge）：双链dna在沿变性剂（甲醛或尿素）电场方向递增的凝胶中进行到与dna变性温度（tm）一致的位置时，dna发生部分解链，迁移率下降。正

13、常dna分子与突变dna分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同位置解链，导致迁移率不同而被分离。两个同源双链dna分子间有一个碱基对不同时，tm值就相差1或更高，有一个碱基错配的异源双链dna分子与同源双链dna分子比较，其tm值可相差6以上。 dnadna芯片技术（芯片技术（dna chipdna chip）：建立在杂交测序基本理论上的dna分析技术。利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品杂交，在一步实验中获取大量信息。可用于基因定位、dna测序、突变分析、表达分析、基因多态性分析、物理图谱和遗传图谱的构建等。使用了光控固相化学合成、集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针等多项

14、先进技术，实验全部自动化，操作极简便，可节约大量时间和实验成本。 将许多已知序列的寡核苷酸dna排列在一块集成电路板上，彼此间重叠1个碱基，并覆盖全部检测基因。将荧光标记的正常和突变dna分别与两块dna芯片杂交，因至少存在1个碱基差异，将得到不同的杂交图谱，用共聚焦显微镜分别检测其荧光信号，即可确定是否存在突变。 蛋白质芯片、组织和细胞芯片 连接酶链反应连接酶链反应（ligase chain reaction，lcr）：双链dna经加热变性后，用2对互补寡核苷酸引物与模板复性。若引物序列与目标序列完全配对，那么2对引物将与各自的目标片段杂交，并在连接酶作用下发生连接。连接产物作为下一次循环的

15、模板。若点突变出现在目标片段上，将不能进行连接反应，不会出现连接产物。 等位基因特异性扩增法等位基因特异性扩增法（allele-specific amplification，asa） ：设计2个等位基因特异的5端引物（一个对野生型特异，一个对突变型特异特异）。对于纯合型突变，分别加入两种引物及3端引物进行两个平行pcr，只有与突变dna完全互补的引物才能延伸得到pcr产物；对于杂合性突变需定量分析。若错配位于引物3端，则pcr不能延伸，称为arms（amplification refractory mutation system）；若错配位于引物之间而影响引物退火，称cop或cca（compe

16、tiive oligonucleotide priming，color complementation assay）。 染色体分析染色体分析 ：肿瘤细胞的染色体畸变是一非常普遍的现象，可分为原发和继发2类： 原发性染色体畸变与引起肿瘤的直接原因有关。肿瘤细胞中可发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、断裂、核内再复制等。 继发性染色体畸变主要是肿瘤细胞核型的改变。 fish：利用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，可同时检测间期与中期细胞的若干个特异性核酸序列。从而能检测多个基因，分辨复杂的染色体易位和微小缺失，区分间期细胞多倍体与超二倍体等。 主要原理：主要原理

17、：基本反应包括在溶液中经化学修饰的单链探针dna序列与固定于载玻片上经变性的单链互补dna序列间形成异质双链，再用与荧光素（fitc）结合的阅读分子定位化学修饰的探针。在总的dna背景上出现有清晰界限的荧光斑点或成簇的荧光斑点。 prinsprins技术技术（寡核苷酸引物原位dna合成，oligonucleotide primed in situ dna synthesis）：用非标记的寡核苷酸引物与染色体上靶序列特异性地杂交，在dna聚合酶作用下引物延伸时，掺入标记的核苷酸，可直接或间接检查标记位点。 比较基因组杂交比较基因组杂交（comparative genomic hydridizat

18、ion，cgh）：直接检测两个全基因遗传物质不平衡（缺失或扩增）的新方法。 原理：用不同的非同位素标记物，分别标记被检基因组dna（常为肿瘤dna）和正常人基因组dna，两者以1 1混合后制备探针，共同与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制（ciss）杂交，对不同的荧光物质分别进行检测，以每条染色体长轴个位点的被测dna与正常dna荧光强度比，反映两组dna不同序列的相对拷贝数，并能同时在染色体上定位。（通常肿瘤dna用fitc标记为绿色，正常基因组dna用tritc标记为红色）。 dna序列分析序列分析 （5）限制性酶切片段长度多态性分析限制性酶切片段长度多态性分析 rflp：（restr

19、iction fragment length polymorphism）当个体的dna用限制性内切酶切割时，所得到的与正常相比，长度有改变的基因片段。多态性：多态性：在不同个体dna结构上有许多地方有差异，尤其是不编码蛋白质的区域和无重要调整功能的区域表现得尤为突出。在一个基因座上，存在两个或以上等位基因，由这些等位基因所决定的两种或以上的表达或基因型，其中任一种在人群中的频率不低于1%，称为多态性。 直接法：通过限定的内切酶酶切基因组dna后，与特异性探针杂交后分析；间接法：选用原基因外两翼核酸序列上的多态性探针，用间接连锁法分析。 （6）端粒酶与肿瘤的关系及检测端粒酶与肿瘤的关系及检测 端粒端粒（telomere）：位于细胞染色体末端的由220kb串联的短片段重复序列（ttaggg）n及一些结合蛋白组成的特殊结构。在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。人的端粒长达15kb，随着细胞分裂逐渐缩短，每次丢失约50200个核苷酸。缩短到一定程度，即不能维持染色体稳定时，细胞进入凋亡。与正常细胞相反，肿瘤细胞的端粒长度不随细胞分