第二章色谱法基本原理

1、第二章 色谱基本原理 2.1 概论 2.2 色谱分配平衡 2.3 塔板理论 2.4 速率理论 2.5 影响谱带扩宽的其他因素 2.6 分离度及其影响因素 2.7 分析时间的最佳化2.1 概论2.1.1 色谱基本流程流动相进样器流速控制与测量色谱柱检测器数据记录与处理系统2.1.2 色谱流出曲线及常用的术语和参数色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图） 指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间的曲线图称色谱流出曲线。间的曲线图称色谱流出曲线。2.1.2 色谱流出曲线及常用的术语和参数（1）基线 ：实验条件下，只有纯流动相通过检测器

2、时的记录信号 基线稳定基线漂移基线（低频）噪声基线（高频）噪声（2）色谱带：组分在柱内的浓度分布构型（3）色谱峰：组分通过检测器产生的响应信号 记录的微分曲线。（4）峰高 ：色谱峰顶到基线的垂直距离（4）保留值 ：组分在色谱床中的滞留情况l用时间表示保留时间 t r 死时间 t m 调整保留时间mrrttt,l用体积表示死体积cmmftv.保留体积cmrftv.调整保留体积crmrrftvvvcf校正到柱温的流动相体积流速（ml/min）().owccoorpptffptof室温下，皂膜流量计测得的流速大气压（柱出口的压力）op室温时水的饱和水蒸气压wpct柱温rt室温校正保留体积 ：柱内平均

3、压力下的平均流速 乘以保留时间所得到的体积。orvcrcrorfjtftv.j 压力校正因子1)/(1)/(2332oioippppj式中： 为大气压, 为柱前压力opipcfccjff 柱内平均压力下的平均流速,净保留体积:jvvrn.比保留体积 :指 时每克固定液的净保留体积 clngtwvv273gvc00 式中: 为柱温， 为固定液重量ctlw相对保留值r2,1：两个不同组分的调整保留值之比。 1212(1)r(2)r1 ,2kkkkttr（6）区域宽度 :色谱峰的宽度标准偏差 ：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半半峰宽 ：2/1w4bw峰底宽度:354. 2w2/12.2 色谱的平衡

4、2.2.1分配系数与柱温的关系 组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度kmscc 在一定温度下，分配体系达到平衡时，组分在两相的浓度之比称为分配系数k。 k由组分和两相的热力学性质决定，随柱温而变化。 当色谱体系和分离对象确定以后， k 只与柱温有关， 其关系式为 ：相对于标准状态的自由能气体常数色谱柱柱温（k）0grct 一般情况组分在固定相的 为负值，则 与 成反比。0gctk2.2.2 分配比 （分配容量、容量因子、容量比） 指在一定的柱温下，组分在两相达到分配平衡时，分配在固定相和流动相的总量之比。smvv式中， 称为色谱体系相比( )注意 ：1 是指真正参与组分在两相分配的那一部分

5、有效体积 分配色谱固定液的体积 吸附色谱吸附剂表面积 离子交换色谱离子交换剂的交换容量 排阻色谱多孔固定相孔容2 为柱内流动相的体积（柱死体积）svmvmv流动流动相停滞流动相实际测定时包括了进样器，连接管，检测器的死体积。2.2.3 分离因子（选择比、溶剂效率）12kk 12kk 对一定色谱柱，两相的体积比 一定，则msvv1 ,2)1(r)2(r)1(r)2(r12rvvttkk 不同浓度溶液中溶质迁移所引起的自由能 变化，对组分1和组分2有： 0g)1(c10klnrtg )2(c20klnrtg 两组分自由能变化的差值 应为 )(0g lnrtkklnrt)g()1()2(0 当 时，

6、 ，组分不能分离。 主要由两相的性质决定。同时也会受柱温的影响。 与柱长、柱径、流动相速度、柱填充情况无关。0)(0g12.2.4 分配等温线 分配系数随组分浓度变化的规律称为分配等温线。典型的分配等温线有三种，线性、凸型、凹型。abck与c无关c增大，k减小c增大，k增大2.2.5 基本保留方程式 组分在柱内的移动速度取决于组分在两相中的分配。组分在固定相时，迁移速度 组分在流动相时，迁移速度所以，有保留组分谱带的迁移速度10su 2suusuu设色谱柱长对于溶质分子:mltusrultmmmrktt)k1(tt mmrtttk 对于流动相分子:( 可从色谱图直接测定）klmmmrkvv)k

7、1(vv 若用保留体积 代替 ，则rvrtmsvvkk 因为：smrkvvv 基本保留方程式所以 因为保留值与有关,装置改变时保留 值不同色谱基本保留方程式的物理意义 组分的保留值取决于组分的k和色谱体系的, 色谱装置 (vm与vs)一定时,相比一定,组分保留值取决于k(组分的本性),故可作为定性的依据色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义： 色谱峰数色谱峰数=样品中组份的最少个数；样品中组份的最少个数； 色谱保留值色谱保留值 色谱峰高或面积色谱峰高或面积 色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的

8、依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。定性依据；定性依据；定量依据；定量依据；例例1：在某色谱分析中得到下列数据：保留：在某色谱分析中得到下列数据：保留时间（时间（tr）为）为5.0min，死时间（，死时间（tm）为）为1.0min，液相体积（，液相体积（vs）为）为2.0ml，柱出口，柱出口载气体积流速（载气体积流速（fo）为）为50ml/min，试计算，试计算：（1）保留因子）保留因子k（2）死体积）死体积vm（3）分配系）分配系数数k（4）保留体积）保留体积vr解解：（1）k= tr/ tm=（5.0-1.0）/1.0=4.0（2） vm = fo tm =50 1.0=50ml（3）

9、 k = k vm / vs =4.0 50/2.0=100 （4） vr = fo tr =50 5.0=250ml2.3 塔板理论（plate theory） 1941年，马丁等人提出了塔板理论,把色谱分离过程比作分馏过程，把色谱柱比作一个分馏塔，并作了四个理想的假设： 2 流动相从柱入口每次以一个 的体积不连续进入3 组分的 在所有的塔板上均为常数4 忽略塔板间的纵向分子扩散1 在柱内一小段长度h内，组分在两相瞬间达到分配平衡，这一小段柱称为一个“理论塔板”，它的长度称为理论塔板高度流动相h n hhlnvk 根据以上假定的条件，讨论组分在两相间的移动分配过程， 假设：(2) 加入柱内的

10、流动相脉冲塔板数n(1) 色谱由5块理论塔板组成，塔板号r0，1，2，3，4 (3) 当加入一个塔板体积 脉冲流动相到0号塔 板时，原来塔板中流动相中的组分就依次冲到 下一个塔板，并在两相间重新分配并达到平衡v(4)塔板上流动相的组分数为q，固定相中的组分数为p。经过n次转移后，分配在各塔板上的组分数符合二项式分布：(p+q)np和q可以从组分的分配比来计算确定。 若组分a的ka=2.0 (p=0.667 , q=0.333),组分b的 kb=0.5 (p=0.333,q=0.667),经过4次转移以后，各塔板上a 、b组分的含量符合由二项式展开后所得的各项值： (p+q)4 = p4 + 4

11、qp3 + 6q2p2 + 4q3p + q4a组分： (0.333+0.667)4 =0.198+0.395+0.296+0.0990+0.0120=1.000b组分： (0.667 + 0.333)4=0.0124+0.0990+0.296+0.395+0.198=1.000a、b组分在柱内各塔板中的浓度分布见表3-1n=0,组分加到0号塔板上0号 1号2号3号4号检测器 平衡时0.5 检 测器0.5 n=1，进1v载气0.5 检 测器0.5 平衡时0.250.25 检 测器0.250.25 n=2,进2v载气 0.250.25 检 测器0.250.25 0.1250.250.125 检

12、测器0.1250.250.125 平衡时0.5 检 测器0.5 n=3,进3v载气 0.1250.250.125 检测器0.1250.250.125 平衡时0.0630.1880.1880.063 检测器0.0630.1880.1880.063 n=4,进4v载气 0.0630.1880.1880.063检测器0.0630.1880.1880.063 平衡时0.0320.1250.1880.1250.032检测器0.0320.1250.1880.1250.0320.250.125 检 测器0.1250.250.125 0.125n=5,进5v载气 0.0320.1250.1880.125检 测

13、 器0.0320.0320.1250.1880.1250.032平衡时0.0160.0790.1570.1570.079检 测 器0.0320.0160.0790.1570.1570.0790.1250.1880.1250.032检测器0.0320.1250.1880.1250.0320.032n=6,进6v载气 0.0160.0790.1570.157检 测器0.0790.0160.0790.1570.1570.079平衡时0.0080.0480.1180.1570.118检 测器0.0790.0080.0480.1180.1570.1180.0160.0790.1570.1570.079检

14、 测 器0.0320.0160.0790.1570.1570.079n=7,进7v载气 0.0080.0480.1180.157检测器0.1180.0080.0480.1180.1570.118平衡时0.0040.0280.0830.1380.138检测器0.1180.0040.0280.0830.1380.1380.0080.0480.1180.1570.118检 测器0.0790.0080.0480.1180.1570.118 以组分数在柱出口出现的分数为纵坐标，流动相板体积n为横坐标作图，就得到色谱流出的曲线。当理论塔板数n50时， 就可以得到较理想的对称峰形。 gc: n=103-10

15、6 流出曲线趋于正态分布曲线色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线的浓度变化方程：色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线的浓度变化方程：m m为组分质量，为组分质量，v vr r为保留体积，为保留体积，n n为理论塔板数。为理论塔板数。当流动相体积当流动相体积v=vv=vr r 时，时，c c值最大，即：值最大，即：当当v vr r-v=1/2w-v=1/2w1/21/2时：时：式中式中n n为理论塔板数，为理论塔板数，w w1/21/2，分别以体积、，分别以体积、时间为单位的色谱峰半高宽度。时间为单位的色谱峰半高宽度。由塔板理论可以导出理论塔板数n的计算公式式中：tr，b，的单位必须相同。对于长度为l的

16、色谱柱，理论塔板高度为：lhn2/1 由于柱内的死体积vm（或tm）不反映出各组分与固定相相互作用的本质，在考虑实际柱能时，应扣除死保留值，以有效塔板数neff作为衡量柱效能的指标。 ，则：上式可以看出：effnn都随值变化很小时，effeffnnnn与差别很大; k时，和使用不同的值的组分，测出的柱效是不同的kkk,effn nk随的 变 化 图l2.4 速率理论（rate theory） 速率理论首先由荷兰学者van deemter 等提出,导出气相色谱速率方程，称为van deemter方程.后来美国科学家j.calvin giddings提出了随机行走的紊流理论模型，并对速率方程式提出

17、补充，进一步提出了液相色谱速率理论方程式。l2.4 .1 紊流模型（random walk）紊流模型的理论要点： 组分分子随流动相通过色谱床时，沿着流动相的方向在一维空间内进行无规则的运动，组分分子随机的向前走。平均步长 l（相当于塔板高度h）行走步数en（相当于理论塔板数）行走距离l（相当于色谱柱长） 多个分子如此随机行走，导致谱带扩宽，扩宽的程度可用正态分布标准偏差 来表示：谱带宽度22eenlnl色谱柱长可以理解为步数en和平均步长的乘积。令步长lh，步数enn，则：2elnlnhhlh的物理意义：单位柱长色谱峰展宽的程度222212.i总 色谱柱总塔板高度 等于各个独立影响因素对板高贡

18、献之和：12i.hhhh总22212.illl2.4.2 广范围的van deemter方程式1.涡流扩散（eddy diffusion）涡流扩散纯属流动状况造成 涡流扩散动画单位柱长对峰宽的影响为式中： 填充颗粒的平均直径 填充因子，与dp粒度范围和填充情况有关高效率柱：采用200-400目粒度范围颗粒 22eddpl22eddplhdpldp 1.52.582.纵向扩散 纵向扩散是分子的无规则热运动引起的，所以也称为分子扩散。 分子扩散动画式中： 弯曲因子，也称为障碍因子，与填充材料的几何形状有关。 dm组分在流动相中的扩散系数，与组分的性质、柱温、压 力、流动相性质有关。 流动相的平均线

19、速度lc：液体没有压缩性，柱内线速度是均匀的gc：气体可压缩，柱内压力从入口到出口递降，载气线速度从入口到出口递升。 uo ：柱出口流速u22212lm mmlmld tduhdu0uju3. 固定相中的传质阻力(resistance to mass tramsfer in stationary phose) 溶质由流动相扩散到固定相、在固定相中溶质要达到平衡时所遇到的阻力。 峰扩展原因：同一组分的分子进出固定相的速度不同 液相固定相：由于分子扩散到固定相不同的深度 吸附色谱：吸附剂表面的活性不同式中： 构型因子，取决于固定相的构型。 均匀液膜：离子交换树脂 固定相（液膜）的平均厚度。 小，有

20、利于迅速建立平衡，柱效高 过小 最大允许进样量小 载体表面的吸附中心暴露，导致峰拖尾 溶质在固定相中的扩散系数2221ssskdfuhqldkq23q ，纸：1;2q 21 5q df sdfvdfdfsd 3.流动相中的传质阻力（resistamce to mass tramsfer in mobile phase) 组分从流动相的主体扩散到流动相与固定相的界面进行质量交换，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力a.流动的流动相中的传质阻力 不同分子与固定相表面的距离不一，到达表面所需要的时间不同。对于气相填充柱色谱：22220.011mmmkdp uhldk对于液相色谱：22mmmdp

21、uhld式中： - 无纲量常数，或称为柱因子b.停滞流动相中的传质阻力 存在于颗粒内部孔隙中的流动相，不随主体流动，故称为停滞流动相2ps mmduld式中：- 与颗粒微孔中被流动相所占据部分 的分数及与容量因子有关的常数联合上述四项影响色谱区带宽化的因素：222222222221elsmsmmmmshldqk df udp udp udpddukd对于气液色谱，2sml不存在，则：2222220.012311msdkdf uk uhdpdukk gc：溶质在气相流动相中传质快，流动相 传质阻力可以忽略，一般采用只有三项的简化vandeamter方程式：上两式均称为速率理论方程式，可以简写为b

22、hacuduubhac uu2.4.3 速率理论方程式的偶合式 giddings以严格的科学方法证明影响塔板高度的各种因素不是独立，而是相互关联的。 涡流扩散和流动相传质效应相互偶合形成 偶合涡流扩散项hem。1121112mememdhhhdpdp u1222222212222200()12120.0123110.012121ememememmsmmmshhhhgiddingskdddfukk uhdpdkkk dp uuddqkdf udp udp uhdpddp uukd随 而变化当时，当时，经典项修改后的速率理论偶合方程式为：液相色谱：md2.4.4 速率理论方程式的讨论（1）流速对塔

23、板高度h的影响曲线的最低点h最小，以hmin表示，柱效能最高。该点对应的流速称为最佳流速：o p tumin2min02optoptuhcudhbcduubuchabc b和可由式：h=a+ 微分求得：ugc曲线与lc曲线不同的原因：dm大，当u低时，分子扩散项2mdu影响显著。min,optmuhhuuh ulc dhmin增大， 显著下降，得到的继续增大，传质阻力占主要地位， 随 增大。：值较小，分子扩散项对h的影响小没有h总趋势是随着u增大， 减小:gc(2)固定相颗粒dp的影响5 1010dphdpmdpmdp 小时， 较小高效率粒子当时，柱效显著下降。但 小，柱的渗透性小，柱前压力高

24、，对仪器性能要求高。2.5 影响谱带扩宽的其他因素 1.非线性色谱 速率理论假定分配等温线是线性的，在实际工作中，经常遇到的是非线性等温线。2.活性中心的影响 载体或吸附剂表面的活性中心对组分的吸附力太强，使组分迟迟不得释放而造成拖尾。解决办法： 将载体进行预处理，去除表面的活性中心； 在lc中，在流动相中加入缓和剂。 3.柱外效应 进样的方式和进样技术，以及进样器、检测器、连接管的死体积造成的谱带扩宽，称为柱外效应。 柱外效应常用柱外效应引起峰体积的相对增大值作为度量指标： 峰体积4bccvw ff峰进样器1dv 色谱柱2dv检测器222总柱内柱外总宽化 22222444cccfff2总柱

25、内柱 内22vv总柱 内柱 外即 v 柱内宽化服从速率理论方程柱外某连接管溶质的宽化为： 式中， d:连接管内径(0.25-0.3mm) l:连接管的长度 流动相体积流速222 4cimdf lvd:cf1m inml 死体积愈小，柱外宽化愈小，一般控制不超过 总宽化的10%。影响谱带扩展的各种因素为：四种动力学因素涡流系数纵向分子扩散固定相传质阻力流动相传质阻力其他非线性等温活性中心死体积进样管连接管检测器其他进样技术气化温度2柱内2柱 外2总2.6 分离度及其影响因素2.6.1 分离度的定义色谱分离的三种情况实现分离的条件峰间距：峰宽：柱效能增大 ，峰宽减小 l全面反映两峰分离程度的参数分

26、离度rl相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的峰底宽度之和的一半的比值称为分离度r对于对称的高斯峰 (1)(2)(2)(1)4 ,4bbbrrttr当时，r=0.8时，分离程度89r=1.044981.5699.87r时， 分离（峰间距），分离程度 时， 分离，分离程度一般采用r=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。2.6.2 基本分离方程式(1)( 2 )( 2 )(1)( 2 )(1)( 2 )( 2 )(1)( 2 )(1)( 2 )( 2 )( 2 )1,21,2( 2 )( 2 )( 2 )( 2 )( 2 )2( 2 )( 2 ),1211116,164bbrrrrbbbrrrrrbb

27、brrreffreffeffbbttttrtttttrrtttntnn假 设 相 邻 两 峰 的 峰 底 宽 度 相 等 ， 即 上式称为基本分离方程式，是色谱分析中最重要的方程式之一，可以计算给定体系所能达到的分离度和达到某一分离度所需的色谱柱长。2.6.3 影响分离度的因素（1）色谱柱效nnr增 大 ，增 大增加n的方法：降低h，制备性能优良的柱子，在最优化的条件下操作。增加柱长：a.若系统压力不变，则必须降低流速，b.若分析时间不变，则必须增大柱压，对设备要求提高（2）相对保留值a增大，柱选择性提高，r增大。1.01.001 1.011.11.52.000.001 0.010.091 0

28、.330.51 从1.01 1.1，增加9。r增加9倍。从1.5 2.0，增加33。r增加1.5倍。1，改变，r增大。较大时，对r的影响小，1-2已足够。若要达到一定的分离度，在k不变的情况下，的微小增加，将使n显著 下降。 1.011.031.051.071.101.201.301.0163000189007060374019405763011.53670004250015900842043601300677rn 改变的方法gc：固定相，柱温lc：固定相，流动相（3）分配比 k即分离度正比于溶质在固定相中所占的分数。总的说，k增大，r增大。k00.51.02.03.05.01050100 00.330.50.670.750.850.910.980.99当k很小时，随k增大，r增大。k5以后，k增大，r的增加缓