第九章分光光度法简介

1、琼州学院生物科学与技术学院2009/11/02一、光的性质 光是一种电磁波。根据波长不同，光学光谱可分为：紫光（10nm-400nm）、可见光区（400nm-760nm）、红外区（760nm-300m）。 白光为复合光，可分为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光。 若两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合后成为一种白光，则这两种单色光称为互补色光。 当一束白光通过某溶液时，由于溶液选择性地吸收了可见光域中某波段的光，而使溶液呈不同颜色，与吸收光颜色互补。例： 硫酸铜水溶液呈蓝色是因为吸收白光中的黄色呈其补色。 高锰酸钾水溶液呈紫色是因为吸收白光中的绿色呈其补色。溶液的颜色和吸收光颜色的关系颜

2、色波长/nm黄绿紫400450黄蓝450480橙绿蓝4804 90红蓝绿490500紫红绿500560紫黄绿560580蓝黄580600绿蓝橙600650蓝绿红650750吸收光物质颜色吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：（1）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长度最大处对应的波长称为最大吸收波长max 。 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（2）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似max不变。不变。 在在max

3、处，吸光度处，吸光度a正比于浓度正比于浓度c。测定最灵敏。测定最灵敏（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。性分析的依据之一。（4）从吸收曲线形状可以解释物质的颜色。物质的颜色）从吸收曲线形状可以解释物质的颜色。物质的颜色与吸收光颜色互为互补色。与吸收光颜色互为互补色。光的互补：光的互补：蓝蓝 黄黄一、光度分析法：在光谱分析中，依据物质分子对光的选择性吸收的特性而建立起来的分析方法称为光度分析法主要有 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围800nm50m 。 主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱

4、，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区）。 可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400800nm ，主要用于有色物质的定量分析。（1）灵敏度高；（2）准确度高；（3）操作简便、快速；（4）应用广泛。朗伯朗伯-比尔定律比尔定律：当一束平行单色光通过含有当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即，即 a=lg =b bc式中：a a 为吸光度； 摩尔吸光系数，单位l/mol.cm，与与吸光物质的本性吸光物质的本性，入射，入射光波光波长长及及温

5、度温度等因素有关；等因素有关；c为吸光物质浓度，为吸光物质浓度，单位单位mol/l；b为透光液层厚度，单位为透光液层厚度，单位cm；i0为入射光强度，i为透射光强度。i0i朗伯比耳定律公式的物理意义： 当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 是各种有色物质在一定波下的特征常数，它可衡量显色反应的灵敏度。其值越大，表示该有色物质对此波长光的吸收能力愈强，显色反应愈灵敏。例1 有一5.00gl-1fe2+溶液，用1,10-二氮菲显色，溶液为深红色，用比色法测定，吸收池厚度为2cm，于波长650nm处测量，得a=0.190，试计算该显色反应的。例2 一

6、粉红色co(h2o)62+溶液，在1.0cm吸收池中，于波长530nm时测得a=0.20，已知该显色反应的=10lmol-1cm-1，问此配合物的浓度是多少？l 依据依据beerbeer定律，定律，a a与与c c关系应为经过关系应为经过原点的直线原点的直线cba 偏离朗伯偏离朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素（1）入射光为非单色光）入射光为非单色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。律偏离

7、。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。特性变化大。所以，只有在一定的浓度范围内吸收光度才能与被测组分的浓度成正比关系1、目视比色法 用眼睛观察来比较溶液颜色深浅以确定物质含量的方法称为目视比色法。光电比色法用光电比色计测量一系列物质的吸光度，从而绘制标准曲线，再根据被测溶液的吸光度，从标准曲线上求得其浓度和含量。 其作用原理和测量方法与光电比色法基本相同，不同的仅仅是获得单色光的方法不同。光电比色法

8、是通过滤光片获得某一段波长范围的光，而分光光度法是借助棱镜或光棚等分光器，并用狭缝分出波长范围很窄的一束近似的单色光。一、主要部件的性能与作用一、主要部件的性能与作用基本结构基本结构:光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统 样品样品紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 在紫外可见分光光度计中，常用的光源在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源有两类：热辐射光源和气体放电光源 1 光源光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。氢

9、灯和氘灯。单色器的主要组成：入射狭缝、出射单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。狭缝、色散元件和准直镜等部分。 2 单色器单色器 单色器质量的优劣，主要决定于单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。和光栅。 吸收池又称比色皿或比色杯，按材吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。者不能用于紫外区。 3 吸收池吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以之间，其中以1cm光径吸收池光径吸收池最为

10、常用。最为常用。4 检测器检测器 检测器的作用是检测光信号，并将检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。为检测器。5 信号显示系统信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。字显示装置等。 紫外紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴

11、定、结构分析。定、结构分析。1.定性分析定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。的困难。紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用 2.纯度的鉴定纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用a280/a260的比值，鉴定其纯度。的比值，鉴定其纯度。 3.结构分析结

12、构分析 紫外紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。该物质无共轭结构和芳香结构。1朗伯朗伯-比耳定律的物理意义是什么？比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表达式。写出其数学表达式。思考题思考题答：当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶液的吸光度a与液层的厚度b和溶液的浓度c成正比。即a= lg(i0 / i) = bc答：摩尔吸光系数在数值上等于1moll-1吸光物质在1cm光程中的吸光度。它是吸光物质在特定波长下的一个特征常数。其单位为l mol-1 cm-1。由于值与入射光波长有关，故表示时，应注明所用入射光波长。在分析化学中，值的大小反应了：（1）吸光物质对某一特定波长光吸光能力大小的量度。值越大，该吸光物质的吸光能力越强。（2）衡量光度分析方法灵敏度的重要指标，值越大，方法的灵敏度越高。答：以入射光波长作横坐标，用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线，称为吸收曲