4第二章酶的生产

1、第二章 酶的生产孙利芹 海洋学院孙利芹孙利芹2011制作制作 提纲提纲l 2.1 概述概述l 2.2 酶的合成模式与代谢调控酶的合成模式与代谢调控l2.3 液体法酶的生产液体法酶的生产l2.4 固体法酶的生产固体法酶的生产孙利芹孙利芹2011制作制作 酶的生产方法酶的生产方法 提出法提出法：直接从动植物或微生物内利用：直接从动植物或微生物内利用化学等手段化学等手段提取酶。提取酶。 如胰蛋白酶直接从胰脏中提取，木瓜蛋白酶直接如胰蛋白酶直接从胰脏中提取，木瓜蛋白酶直接 从木瓜中提取。从木瓜中提取。 发酵法：发酵法：经过预选设计，通过人工操作控制，利用细胞经过预选设计，通过人工操作控制，利用细胞 （

2、包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动产生（包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动产生 人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵法生产。人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵法生产。 2.1 概述概述孙利芹孙利芹2011制作制作 （1 1）酶的产量高；（）酶的产量高；（2 2）易于培养和管理；（）易于培养和管理；（3 3）产酶性能稳定；）产酶性能稳定；（4 4）利于酶产品的分离纯化；（）利于酶产品的分离纯化；（5)5)安全可靠安全可靠 发酵常用的微生物发酵常用的微生物: : (1)(1)枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌用于生产用于生产-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等；淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等； (2)(2)e

3、.coli-e.coli-用于生产谷氨酸脱羧酶、用于生产谷氨酸脱羧酶、aspasp酶、酶、-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶等 (3)(3)黑曲霉黑曲霉- -用于生产糖化酶、用于生产糖化酶、 -淀粉酶、酸性蛋白酶等淀粉酶、酸性蛋白酶等 (4)(4)米曲霉米曲霉- -生产糖化酶、蛋白酶等。生产糖化酶、蛋白酶等。 优良产酶细胞应具备的条件：优良产酶细胞应具备的条件：孙利芹孙利芹2011制作制作微生物生长繁殖速度快微生物生长繁殖速度快，整个酶的生产周期可以缩短，酶产，整个酶的生产周期可以缩短，酶产量可以无限的扩大。量可以无限的扩大。微生物的种类繁多微生物的种类繁多，同一种微生物在不同的条件下，其生长，同一种微

4、生物在不同的条件下，其生长代谢的机制也不相同，那么涉及到的各种酶也就不相同，这代谢的机制也不相同，那么涉及到的各种酶也就不相同，这就为各种各样的酶的生产提供了基础。就为各种各样的酶的生产提供了基础。 例如：同样是微生物发酵生产例如：同样是微生物发酵生产lyslys，在大肠杆菌中，在大肠杆菌中lyslys的合成的合成途径与途径与谷氨酸棒谷氨酸棒杆菌杆菌lyslys的生物合成途径有很大的差异，所以的生物合成途径有很大的差异，所以可以利用不同的微生物分别生产不同的酶。可以利用不同的微生物分别生产不同的酶。 微生物发酵生产占主导地位的原因：微生物发酵生产占主导地位的原因：孙利芹孙利芹2011制作制作

5、微生物发酵生产酶的生产方法微生物发酵生产酶的生产方法按照微生物培养基形态按照微生物培养基形态 1.1.固体法酶的生产：固体法酶的生产：将微生物菌种接种在固体培养基上（以麸皮、米糠将微生物菌种接种在固体培养基上（以麸皮、米糠等为主要原料），在微生物生长的过程中，可以根据其生长的状态，间等为主要原料），在微生物生长的过程中，可以根据其生长的状态，间歇式的通风、喷水，以保证微生物在生长过程中对氧的需求，对温度的歇式的通风、喷水，以保证微生物在生长过程中对氧的需求，对温度的控制。控制。 优点：优点：（1 1）设备投资少，易于上马，适合于中小型企业。）设备投资少，易于上马，适合于中小型企业。 （2 2）

6、生产管理要求不高，对于培养过程中的无菌程度要求）生产管理要求不高，对于培养过程中的无菌程度要求 也不高，这就相应的降低了生产成本。也不高，这就相应的降低了生产成本。 （3 3）单位产品的酶活力较高。）单位产品的酶活力较高。 缺点：缺点：（1 1）无菌程度较低，生产的酶制剂大部分是水解酶类，而）无菌程度较低，生产的酶制剂大部分是水解酶类，而 且往往只适合于混合物的水解。且往往只适合于混合物的水解。 （2 2）发酵周期较长，通常需要）发酵周期较长，通常需要4-54-5天。天。 （3 3）生产过程中工人的劳动强度较大。）生产过程中工人的劳动强度较大。孙利芹孙利芹2011制作制作2.2.液体法酶的生产

7、：液体法酶的生产： 又称为，液体深层培养又称为，液体深层培养, ,采用液体培养基至于发酵容器中，经灭菌、采用液体培养基至于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。是现代意义上的酶制剂冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。是现代意义上的酶制剂生产方法。生产方法。 优点：优点：（1 1）微生物生长在液体培养基中，有着良好的控温、传）微生物生长在液体培养基中，有着良好的控温、传 质的条件，生长速度较快，生产效率高，自动化程度高。质的条件，生长速度较快，生产效率高，自动化程度高。 （2 2）无菌程度较高，发酵液中的酶的种类比较单一，有利于）无菌程度较高，发酵液中的酶的种类比较

8、单一，有利于 酶制剂的分离提出。酶制剂的分离提出。 缺点缺点：（：（1 1）由于生产过程中的无菌程度较高，生产成本增加。）由于生产过程中的无菌程度较高，生产成本增加。 （2 2）产品往往需要分离、浓缩的等后处理，增加了设备投资）产品往往需要分离、浓缩的等后处理，增加了设备投资 和生产成本。如果生产粉剂型的生产成本更高，如果生和生产成本。如果生产粉剂型的生产成本更高，如果生 产液剂型的，则产品的保质期较短，且需要添加防腐剂。产液剂型的，则产品的保质期较短，且需要添加防腐剂。孙利芹孙利芹2011制作制作按照微生物的培养方式按照微生物的培养方式 1.1.微生物的纯培养：微生物的纯培养：指单一的微生物

9、菌种的培养，包括固体和液体培养。指单一的微生物菌种的培养，包括固体和液体培养。 2.2.混合培养：混合培养：多菌种的混合培养，大多数情况下是利用空气或者原料本多菌种的混合培养，大多数情况下是利用空气或者原料本身所含有的微生物菌群接种培养，利用培养过程中的温度的调整来选身所含有的微生物菌群接种培养，利用培养过程中的温度的调整来选择或者说淘汰某些微生物。通常采用固体培养。择或者说淘汰某些微生物。通常采用固体培养。 混合培养方法目前在我国的白酒生产领域仍然广泛的使用，其产品混合培养方法目前在我国的白酒生产领域仍然广泛的使用，其产品又称之为：大曲、药曲等，有着浓厚的地方特点。这种生产方法的主又称之为：

10、大曲、药曲等，有着浓厚的地方特点。这种生产方法的主要要缺点是缺点是，生产效率较低，酶制剂中以水解酶类为主，而且水解酶类，生产效率较低，酶制剂中以水解酶类为主，而且水解酶类的种类比较复杂，适合于混合原料的水解工艺；从工业化的角度讲，的种类比较复杂，适合于混合原料的水解工艺；从工业化的角度讲，产品有着浓厚的地方特点，难以标准化。产品有着浓厚的地方特点，难以标准化。 酶的液体深层培养生产方法，是建立在现代发酵工业的理论与实酶的液体深层培养生产方法，是建立在现代发酵工业的理论与实践的基础上的践的基础上的. .两种方法的发酵，酶的生物合成机制，酶发酵的基本理两种方法的发酵，酶的生物合成机制，酶发酵的基本

11、理论是相同的论是相同的 孙利芹孙利芹2011制作制作2.2 酶的合成模式与代谢调控酶的合成模式与代谢调控酶生物合成的调节机制酶生物合成的调节机制 原核生物细胞中酶生物合成的调节原核生物细胞中酶生物合成的调节 真核生物细胞中酶生物合成的调节真核生物细胞中酶生物合成的调节酶生物合成的模式酶生物合成的模式提高酶产量的方法提高酶产量的方法孙利芹孙利芹2011制作制作 细胞合成的酶按其在细胞中量的变化，可分为：细胞合成的酶按其在细胞中量的变化，可分为： 组成型（组成型（constitutiveconstitutive）: : 酶在细胞中的量比较恒定，环境因酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的影响不

12、大，如素对这些酶的影响不大，如dnadna聚合酶、聚合酶、rnarna聚合酶、糖酵解途径的聚合酶、糖酵解途径的各种酶。各种酶。 适应型（适应型（adaptiveadaptive）: :酶在细胞中的含量变化很大，其合成速酶在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响，又称调节型的酶，如率明显受到环境因素的影响，又称调节型的酶，如e.colie.coli的的-半半乳糖苷酶乳糖苷酶( (几个分子到几千个分子的差别几个分子到几千个分子的差别) ) 适应性酶的生物合成控制方式：适应性酶的生物合成控制方式：转录水平调节；转录产物的加工转录水平调节；转录产物的加工调节；翻译水平的调节；翻译产物的

13、加工调节；酶降解的调节等。调节；翻译水平的调节；翻译产物的加工调节；酶降解的调节等。酶生物合成的调节机制酶生物合成的调节机制孙利芹孙利芹2011制作制作一、原核生物细胞中酶生物合成的调节一、原核生物细胞中酶生物合成的调节操纵子学说的提出操纵子学说的提出 jacob和和monodmonod于于19601960年提出，阐明原核生物基因调节理论年提出，阐明原核生物基因调节理论 根据基因调节理论，原核生物根据基因调节理论，原核生物dnadna分子中，与酶生物合成分子中，与酶生物合成有密切关系的基因有有密切关系的基因有4 4种，分别是：种，分别是： r-r-调节基因（调节基因（regulator gen

14、eregulator gene）: :调节基因可以产生一种阻调节基因可以产生一种阻遏蛋白遏蛋白. . 阻遏蛋白：阻遏蛋白：是一个由多个亚基组成的变构蛋白，它是一个由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合能力。合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合能力。 孙利芹孙利芹2011制作制作s-s-结构基因（结构基因（structural genestructural gene）: :与多肽链有各自的对应关与多肽链有各自的对应关系，其上的遗传信息可以转录成系，其上的遗

15、传信息可以转录成mrnamrna上的遗传密码，在经上的遗传密码，在经翻译成酶蛋白的多肽链。翻译成酶蛋白的多肽链。o-o-操纵基因（操纵基因（operator geneoperator gene）: :可以与调节基因产生的阻遏可以与调节基因产生的阻遏蛋白中的一种结构结合蛋白中的一种结构结合, ,从而操纵酶生物合成的时机和合从而操纵酶生物合成的时机和合成速度成速度. .p-p-启动基因（启动基因（promoter genepromoter gene）: :决定酶的合成能否开始决定酶的合成能否开始 p p上有两个位点组成上有两个位点组成: : 一个是一个是rnarna聚合酶的位点聚合酶的位点, ,另

16、一个是另一个是环腺苷酸环腺苷酸(camp)(camp)与环腺苷酸受体蛋白与环腺苷酸受体蛋白(crp)(crp)组成的复合物组成的复合物的位点。的位点。孙利芹孙利芹2011制作制作操纵子（操纵子（operonoperon）：是基因表达的协调单位，由启动子、是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。组成。操纵基因受调节基因产物的控制。 原核生物中操纵子有两种类型：原核生物中操纵子有两种类型：诱导型操纵子；诱导型操纵子； 阻遏型操纵子阻遏型操纵子pros1s2s3 诱导型操纵子诱导型

17、操纵子（inducible operon） 在无诱导物情况下，其基因的表达水平很低或不表达，只在无诱导物情况下，其基因的表达水平很低或不表达，只有在诱导物存在的条件下才能转录生成有在诱导物存在的条件下才能转录生成mrna,mrna,进而合成酶进而合成酶, ,如如乳糖操纵子乳糖操纵子. . 阻遏型操纵子阻遏型操纵子（repressible operon） 在无阻遏物存在的情况下基因正常表达在无阻遏物存在的情况下基因正常表达, ,当有阻遏物时当有阻遏物时, ,转录转录受到阻遏受到阻遏, ,如色氨酸操纵子如色氨酸操纵子. . 此外此外, ,启动基因通过启动基因通过camp-capcamp-cap复合

18、物的结合与否复合物的结合与否, ,对酶的对酶的生物合成起调节作用生物合成起调节作用转录水平的调节有转录水平的调节有3 3种模式种模式: :分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用; ;酶合酶合成的诱导作用成的诱导作用; ;酶合成的反馈阻遏作用酶合成的反馈阻遏作用孙利芹孙利芹2011制作制作分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用l葡萄糖效应：葡萄糖效应：1942年年monod发现将大肠杆菌培养在含葡萄糖的培养发现将大肠杆菌培养在含葡萄糖的培养基上时，葡萄糖被优先利用，同时葡萄糖阻遏基上时，葡萄糖被优先利用，同时葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的诱导合半乳糖苷酶的诱导合成。成。l分解代谢物阻遏：分解代谢物阻遏：细

19、胞具有一优先利用的底物（通常是，但不总是细胞具有一优先利用的底物（通常是，但不总是葡萄糖）时，很多其它分解反应途径受到阻遏。葡萄糖）时，很多其它分解反应途径受到阻遏。分解代谢物阻遏的实质？分解代谢物阻遏的实质？ 分解代谢物阻遏是怎样在分子水平上起调节作用的？分解代谢物阻遏是怎样在分子水平上起调节作用的？或或campcamp是怎样控制酶水平的？是怎样控制酶水平的？细胞内缺少了环腺苷酸细胞内缺少了环腺苷酸campcamp孙利芹孙利芹2011制作制作调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacz lacylacacapcampcap-campcap-camp复合物复合物mrnamrna+细菌乳

20、糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏降解物阻遏)过去称过去称葡萄糖效应葡萄糖效应 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 - -半乳糖苷透过酶半乳糖苷透过酶 - -半乳糖苷乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶酶基转移酶酶当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则campcamp的浓度降低，的浓度降低， cap-campcap-camp复合物减少，不能与启动子结合，故转复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。录不得进行。孙利芹孙利芹2011制作制作以以campcamp在乳糖操纵子转录中的作用为例在乳糖操纵子转录

21、中的作用为例转录开始时：转录开始时：1. camp与与cap结合结合成成camp-cap复合物；复合物； 2. camp-cap复合物与乳糖操纵子启动基因上的复合物与乳糖操纵子启动基因上的cap 位点结合，从而活化了位点结合，从而活化了rna聚合酶位点，促进聚聚合酶位点，促进聚 合酶和合酶和rna聚合酶位点的结合；聚合酶位点的结合； 3. rna聚合酶进入聚合酶进入rna聚合酶位点，并向前漂移；聚合酶位点，并向前漂移； 4. rna聚合酶进入操纵基因聚合酶进入操纵基因 o位点内位点内,转录开始转录开始.e.coli内内,camp的胞内水平受三种不同过程的决定的胞内水平受三种不同过程的决定: 1

22、. camp是通过腺苷酸环化酶从是通过腺苷酸环化酶从atp合成的合成的; 2. camp可为磷酸二酯酶降解可为磷酸二酯酶降解; 3. camp可通过细胞膜分泌到外部介质中可通过细胞膜分泌到外部介质中 腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶atpadpampcampamp+camp磷酸二酯酶磷酸二酯酶葡萄糖是如何调节葡萄糖是如何调节campcamp水平的水平的? ?x腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶激活激活抑制抑制磷酸二酯酶磷酸二酯酶葡萄糖葡萄糖葡萄糖分解过程中的某种中间产物抑制了细胞内葡萄糖分解过程中的某种中间产物抑制了细胞内campcamp的形成的形成可能是中间产物激活了可能是中间产物激活了campcamp的分解

23、的分解孙利芹孙利芹2011制作制作catabolite gene activation protein(cap) regulate positively transcription of lac operon genescap site-35-10153rna polymerase-35-10capcampcapcampcap+at glucose presents孙利芹孙利芹2011制作制作受到降解物阻遏的酶类还包括半乳糖、阿拉伯糖、受到降解物阻遏的酶类还包括半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等的操纵子。麦芽糖等的操纵子。受一种调节蛋白控制的几个操纵子构成的调节系统称受一种调节蛋白控制的几个操纵子构成

24、的调节系统称为调节子。为调节子。cap与与camp构成的复合物对各种不同糖分解代谢的构成的复合物对各种不同糖分解代谢的调节即属于一种调节子。调节即属于一种调节子。孙利芹孙利芹2011制作制作 加进某些物质加进某些物质, ,使酶的生物合成开始或加速进行的现象称为酶使酶的生物合成开始或加速进行的现象称为酶生物合成的诱导生物合成的诱导, ,简称简称诱导作用诱导作用 诱导物诱导物(inducer):(inducer):能够引起诱导作用的物质能够引起诱导作用的物质, ,一般为酶催化作用的一般为酶催化作用的 底物或其底物类似物或产物。底物或其底物类似物或产物。 例如：例如：-半乳糖苷酶的的作用底物乳糖及其

25、类似物异丙基半乳糖苷酶的的作用底物乳糖及其类似物异丙基- -d- -d硫硫 代半乳糖苷是其诱导物；代半乳糖苷是其诱导物； 半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，可作为诱导物诱导半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，可作为诱导物诱导 果胶酶的产生；纤维二糖作为纤维素酶的催化产物可诱导纤维果胶酶的产生；纤维二糖作为纤维素酶的催化产物可诱导纤维 素酶的生物合成素酶的生物合成 以乳糖操纵子为例说明酶生物合成的诱导机制以乳糖操纵子为例说明酶生物合成的诱导机制 酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白无诱导存在无诱

26、导存在阻遏蛋白阻挡阻遏蛋白阻挡操纵基因，结构基因不表操纵基因，结构基因不表达达。调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白诱导物诱导物mrna酶蛋白酶蛋白诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白不能阻挡操纵基因，结构基因表达。不能阻挡操纵基因，结构基因表达。 无诱导物存在时，无诱导物存在时，r产生的阻产生的阻遏蛋白与遏蛋白与o的结合能力强，使得的结合能力强，使得已在已在p上的上的rna聚合酶无法经过聚合酶无法经过o进入进入s的位置，遗传信息无法的位置，遗传信息无法转录，酶不能合成转录，酶不能合成 当有诱导物存在时，诱导物当有诱导物存在时，诱导物与阻

27、遏蛋白的结合使阻遏蛋白的与阻遏蛋白的结合使阻遏蛋白的结构发生变化，使之与结构发生变化，使之与o的结合的结合能力弱，能力弱，rna聚合酶经过聚合酶经过o进入进入s的位置，遗传信息转录，酶合的位置，遗传信息转录，酶合成成repressor regulate negatively transcription of lac operon geneszyaiopzyaioprepressor(4 polymer)rna polymerasemrna+galactosecorrespond between negative regulation of repressor and positive regu

28、lation of cap in gene transcription control of lac operon cap site053-35-10rna polymeraseinhibitor geneglucose concentration is lower and lactose concentration is higher camp at glucose absentscapcampcap+capcamprepressor(4 polymer)+galactose孙利芹孙利芹2011制作制作cap site053-35-10rna polymeraseinhibitor gene

29、camp at glucose presents capcampcap+glucose concentration is higher and lactose concentration is lowerrepressor(4 polymer)孙利芹孙利芹2011制作制作 反馈阻遏又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢反馈阻遏又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象 共阻遏物（共阻遏物（corepressor）: 引起阻遏作用的物质引起阻遏作用的物质 例如：例如：无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水

30、解的产物，它的过量无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物，它的过量存在，却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；存在，却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；trp（色氨酸）作为色氨（色氨酸）作为色氨酸合成途径的终产物，过量积累会对其途径中的酸合成途径的终产物，过量积累会对其途径中的4种酶的生物合成种酶的生物合成起反馈阻遏作用。起反馈阻遏作用。 以色氨酸操纵子为例，说明反馈阻遏作用的调节机制：以色氨酸操纵子为例，说明反馈阻遏作用的调节机制： 操纵基因的调节操纵基因的调节 衰减子的调节衰减子的调节酶生物合成的反馈阻遏作用酶生物合成的反馈阻遏作用色氨酸操纵模式色氨酸操纵模式 操纵基因的调节操纵基因的调节调节基因调

31、节基因结构基因结构基因操纵基因操纵基因mrnamrna酶蛋白酶蛋白无共阻遏物存在无共阻遏物存在阻遏蛋白不能与操阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达纵基因结合，结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达变化与操纵基因结合，结构基因不能表达 在没有共阻遏物（色氨酸在没有共阻遏物（色氨酸-trnatrp）存在时，）存在时，r产生的阻遏产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合，能与操纵基因结合，rna聚合酶聚合酶可以

32、结合到启动基因的位点进行可以结合到启动基因的位点进行转录转录 当环境中色氨酸浓度增加，当环境中色氨酸浓度增加，共阻遏物达到一定的浓度，阻遏共阻遏物达到一定的浓度，阻遏蛋白与共阻遏物结合，使其结构蛋白与共阻遏物结合，使其结构发生改变，与操纵基因的结合增发生改变，与操纵基因的结合增强，转录无法进行强，转录无法进行思考题：思考题：反馈抑制与反馈反馈抑制与反馈阻遏的区别？阻遏的区别？ 色氨酸操纵模式色氨酸操纵模式 衰减子模型衰减子模型衰减子：衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰

33、减子衰减子是一种位于结构基因上游前导区的终止子。是一种位于结构基因上游前导区的终止子。pro trpl trpetrpdtrpctrpltrpl: :为前导序列为前导序列, ,有有162162个个bpbp组成组成, ,内有一个调节内有一个调节区区, ,称为制动基因或称为制动基因或衰减子（衰减子（attenuator）孙利芹孙利芹2011制作制作衰减子的调节作用衰减子的调节作用l当细胞内有足够的色当细胞内有足够的色氨酸存在时氨酸存在时rna聚合聚合酶在酶在+90的位置暂停的位置暂停,转录在衰减子区停止转录在衰减子区停止合成前导合成前导mrna链链;l当细胞内色氨酸缺乏当细胞内色氨酸缺乏时时rna

34、聚合酶继续转聚合酶继续转录至结构基因录至结构基因,合成合成完整的完整的mrna分子分子.+90暂停暂停mrnamrna转录继续进行转录继续进行, ,越过制越过制动基因进入结构基因动基因进入结构基因trptrp缺乏缺乏trptrp足量足量 前导前导mrnamrna低浓度色氨酸低浓度色氨酸高浓度高浓度色氨酸色氨酸不能形成终止不能形成终止信号转录得以信号转录得以进行进行形成终止信号形成终止信号转录终止转录终止 前导序列能编码一小段前导序列能编码一小段1414肽肽, ,其终止区具有潜在的茎环构象和成其终止区具有潜在的茎环构象和成串的串的u,u,表现出一般终止位点的特征表现出一般终止位点的特征. . 前

35、导前导rnarna链具有链具有4 4个区域彼此互补个区域彼此互补, ,形成奇特的二级结构形成奇特的二级结构, ,推测由推测由于特殊空间构象控制着转录的进行于特殊空间构象控制着转录的进行trp-trnatrp-trnatrptrp不能形成不能形成孙利芹孙利芹2011制作制作衰减子模型能够较好地说明某些氨基酸的生物合衰减子模型能够较好地说明某些氨基酸的生物合成的调节机制成的调节机制l阻遏和衰减机制虽然都是在转录水平上进行调节，但阻遏和衰减机制虽然都是在转录水平上进行调节，但是它们的作用机制完全不同。是它们的作用机制完全不同。l阻遏控制转录的起始，而衰减控制转录起始后是否能阻遏控制转录的起始，而衰减

36、控制转录起始后是否能继续下去继续下去,衰减作用比之前者是更为精细的调节。衰减作用比之前者是更为精细的调节。l除除trp operon外外,his operon、 phe operon、 leu operon 、thr operon、 ile operon等都具有这两种等都具有这两种调节机制调节机制孙利芹孙利芹2011制作制作细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成 真核生物具有细胞的全能性和基因表达的时间性和空间性真核生物具有细胞的全能性和基因表达的时间性和空间性的特点。的特点。 细胞的全能性细胞的全能性：同一生物个体的不同细胞所含基因的种类和数目同一生物个体的不同细胞所含基因的种类和

37、数目 是一样的是一样的 基因表达的时间性和空间性：基因表达的时间性和空间性：个体发育的不同阶段和不同类型的个体发育的不同阶段和不同类型的分化细胞中分化细胞中, ,基因的表达确有很大的差异基因的表达确有很大的差异 以端粒酶为例说明以端粒酶为例说明二、真核生物二、真核生物细胞细胞中酶生物合成的调节中酶生物合成的调节孙利芹孙利芹2011制作制作衰老是一个极为复杂的不可抗拒的生理过程，是衰老是一个极为复杂的不可抗拒的生理过程，是人类进化发展的必然人类进化发展的必然l分子生物学研究表明，细分子生物学研究表明，细胞内胞内染色体端粒缩短过程染色体端粒缩短过程，是人体衰老的决定因素是人体衰老的决定因素（端粒结

38、构和端粒酶）（端粒结构和端粒酶）l在人体中，幼年期细胞内在人体中，幼年期细胞内的端粒长度远远长于老年的端粒长度远远长于老年期；从细胞的体外培养中期；从细胞的体外培养中发现，随着细胞的分裂，发现，随着细胞的分裂，其端粒逐渐缩短其端粒逐渐缩短。l端粒缩短是触发衰老的分端粒缩短是触发衰老的分子钟。子钟。孙利芹孙利芹2011制作制作端粒的发现端粒的发现l19301930，著名的遗传学家，著名的遗传学家 b.mcclintock b.mcclintock 和和hj.mllerhj.mller发现：发现：染色体的末端可维持染色体的稳定性染色体的末端可维持染色体的稳定性lmllermller将它定义为将它定

39、义为“telomere”telomere”，这是由希腊语，这是由希腊语“末端末端”（telostelos）及）及“部分部分”（merosmeros）组成的。）组成的。l染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，发生结构及染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，发生结构及功能上的改变，从而影响到细胞的分裂与生长功能上的改变，从而影响到细胞的分裂与生长l19701970，eh.blackburn eh.blackburn 利用四膜虫（利用四膜虫（tetrahymenatetrahymena）揭示了）揭示了端粒的初步结构端粒的初步结构: : 由几个核苷酸组成的由几个核苷酸组成的 dna dna 重

40、复片段，富含重复片段，富含tgtg （ttggggttgggg）n n，重复的次数由几十到数千不等，重复的次数由几十到数千不等孙利芹孙利芹2011制作制作端粒端粒dnadna序列序列l人的端粒人的端粒dnadna序列序列长约长约5 515kb15kb序列：（序列：（ttagggttaggg）n n ，串联重复，串联重复不同生物端粒不同生物端粒dnadna长度长度 l酵母酵母 200-400 200-400 bpbpl尖毛虫尖毛虫 20 20 bpbpl小鼠小鼠 5-80 5-80 kbkbl大鼠大鼠 150 150 kbkb dnadna缠绕成的染色体末端，有称做缠绕成的染色体末端，有称做端粒

41、（端粒（telomeretelomere）的的区域。控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变区域。控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变短，短到某个程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞短，短到某个程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞大约能分裂大约能分裂50506060次。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，次。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，而端粒长短就成为表示细胞而端粒长短就成为表示细胞“年龄年龄”的指标。如果加入一的指标。如果加入一种种“端粒酶端粒酶”阻止它缩短，就可使细胞保持年轻，人就像阻止它缩短，就可使细胞保持年轻，人就像吃了吃了“唐僧肉唐僧肉”一样实现长生不老的梦想。一样实

42、现长生不老的梦想。孙利芹孙利芹2011制作制作端粒端粒(telomere)l真核生物染色体线性真核生物染色体线性dnadna分子末端的结构。分子末端的结构。l结构特点：结构特点：1. 1. 由末端单链由末端单链dnadna序列和蛋白质构成序列和蛋白质构成2. 2. 末端末端dnadna序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含g g、t t碱基的短序列碱基的短序列 如：单细胞纤毛生物四膜虫（如：单细胞纤毛生物四膜虫（tetrahymenatetrahymena）端粒）端粒 是由重复序列是由重复序列ttggggttgggg多次重复而成多次重复而成 人的端粒是由重复序列人的端粒是由重复序列5ttag

43、gg35ttaggg3不断重复而成。不断重复而成。 3. 3. 单链单链33末端能形成末端能形成 g-quadruplexg-quadruplex结构结构 4.4.各种不同生物端粒的结构和功能都非常保守各种不同生物端粒的结构和功能都非常保守。g-quadruplex结构结构孙利芹孙利芹2011制作制作维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 保护真核生物的染色体免遭破坏。细胞中存在核保护真核生物的染色体免遭破坏。细胞中存在核酸酶等破坏酸酶等破坏dnadna的外界因素的外界因素 dnadna末端复制问题末端复制问题 真核生物真核生物dnadna复制过程中存在复制过程中存在“末端复制问题末端复制问题”

44、，即，即依赖依赖dnadna的的dnadna聚合酶（复制酶）在每次复制后，都在聚合酶（复制酶）在每次复制后，都在55末端留下一段空隙末端留下一段空隙(rna(rna引物降解后留下的空隙引物降解后留下的空隙) )，若细胞，若细胞无法填补这些空隙，染色体将随着每一次细胞分裂而不无法填补这些空隙，染色体将随着每一次细胞分裂而不断缩短，直至细胞消亡。断缩短，直至细胞消亡。 端粒的功能端粒的功能 端粒的存在不但可端粒的存在不但可以避免外界因素对以避免外界因素对dnadna的破坏，而且可的破坏，而且可以在复制过程中，以在复制过程中，通过牺牲自我而避通过牺牲自我而避免染色体免染色体dnadna受损，受损，以

45、维护染色体结构以维护染色体结构和功能的完整性。和功能的完整性。孙利芹孙利芹2011制作制作可能肿瘤抑制靶点可能肿瘤抑制靶点 端粒自身的鸟嘌呤四联体端粒自身的鸟嘌呤四联体(guanine-quadruplex(guanine-quadruplex) )和一些端和一些端粒特异性结合蛋白对端粒长度、端粒稳定甚至对端粒酶活性粒特异性结合蛋白对端粒长度、端粒稳定甚至对端粒酶活性都有调节作用，在肿瘤形成和生长中发挥重要作用。以此为都有调节作用，在肿瘤形成和生长中发挥重要作用。以此为靶点抑制肿瘤，直接作用于端粒，不依赖端粒酶的存在，对靶点抑制肿瘤，直接作用于端粒，不依赖端粒酶的存在，对端粒酶阴性肿瘤亦有作用

46、。因此，端粒可能成为新的肿瘤抑端粒酶阴性肿瘤亦有作用。因此，端粒可能成为新的肿瘤抑制靶点。制靶点。 端粒的功能端粒的功能(续续)孙利芹孙利芹2011制作制作端粒酶的发现端粒酶的发现 7272年，年，jd.watsonjd.watson发现发现：dna dna 聚合酶不能够完整地复制线性染色质聚合酶不能够完整地复制线性染色质55末端的引物脱落后，末端的引物脱落后，dnadna聚合酶不能完成最后的复制，聚合酶不能完成最后的复制，留下一个单链的间隙留下一个单链的间隙l如果这一间隙不能够被填充，染色体如果这一间隙不能够被填充，染色体dnadna将失去这一将失去这一dnadna片断片断l每经过一次复制、

47、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，每经过一次复制、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，影响到与端粒相邻的一些重要基因影响到与端粒相邻的一些重要基因l科学家们考虑：可能存在着一种不同于科学家们考虑：可能存在着一种不同于dna dna 聚合酶的酶来完聚合酶的酶来完成单链间隙的复制成单链间隙的复制孙利芹孙利芹2011制作制作 19841984，cw.greidercw.greider和和eh.blackburneh.blackburn发现发现：将一段单：将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这就说明了切实有这样的一种酶

48、存在的长度延长了，这就说明了切实有这样的一种酶存在l将它命名为：将它命名为：“端粒酶端粒酶”（telomerasetelomerase）l进一步的研究揭示了端粒与端粒酶在细胞的生长及肿进一步的研究揭示了端粒与端粒酶在细胞的生长及肿瘤发生中有非常重要的意义，现正成为一个研究的热瘤发生中有非常重要的意义，现正成为一个研究的热点点孙利芹孙利芹2011制作制作端粒酶端粒酶(telomerase)特点：特点： 由由rnarna和蛋白质构成的复合物和蛋白质构成的复合物 端粒酶是真核细胞内染色体完全复制的关键酶，是一种端粒酶是真核细胞内染色体完全复制的关键酶，是一种rnarna依赖依赖 的的dnadna聚合

49、酶。为特殊的逆转录酶，能以自身的聚合酶。为特殊的逆转录酶，能以自身的rnarna为模板逆转为模板逆转 录合成端粒录合成端粒dnadna 其活性取决于它的其活性取决于它的rnarna和蛋白质亚基。端粒酶至少包含两个功能和蛋白质亚基。端粒酶至少包含两个功能 性相互作用的性相互作用的rnarna分子，两者都可充当分子，两者都可充当dnadna聚合作用的模板。聚合作用的模板。 端粒酶至少包含两个活性位点端粒酶除了具有反转录活性外，端粒酶至少包含两个活性位点端粒酶除了具有反转录活性外， 还具有核酸内切酶的活性。还具有核酸内切酶的活性。功能：功能：1.1.合成端粒合成端粒dnadna，维持端粒的长度，维持

50、端粒的长度 2.2.合成串联重复的合成串联重复的ttagggttaggg序列为序列为trf2trf2提供结合位，防止染提供结合位，防止染 色体的末端融合。色体的末端融合。孙利芹孙利芹2011制作制作l端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化老化(aging)(aging)及及肿瘤的发生肿瘤的发生有一定关系。有一定关系。l 端粒酶活性存在于端粒酶活性存在于 85%-95%85%-95%肿瘤细胞中，而在正常细肿瘤细胞中，而在正常细胞中不存在。胞中不存在。l可成为肿瘤的诊断标记和治疗靶点。可成为肿瘤的诊断标记和治疗靶点。端粒及端粒酶的意义端粒及端粒酶的意义孙利

51、芹孙利芹2011制作制作 基因扩增加速酶的生物合成基因扩增加速酶的生物合成 通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式, ,例例如中国田鼠细胞在含有甲氨喋呤的培养基中生长时如中国田鼠细胞在含有甲氨喋呤的培养基中生长时, ,编码编码二氢叶酸还原酶的基因急剧扩增二氢叶酸还原酶的基因急剧扩增 增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成 又称变调子又称变调子, ,是一段能高效增强或促进基因转录的是一段能高效增强或促进基因转录的dnadna序列序列, ,能促进同源或异源启动基因的转录活性能促进同源或异源启动基因的转录活性. . 抗体酶生物合成的诱导抗体酶生物合

52、成的诱导 孙利芹孙利芹2011制作制作抗体酶的概念抗体酶的概念l抗体酶抗体酶(abzymecatalytic(abzymecatalytic antibody) antibody)，又称催化抗体，又称催化抗体(catalytic antibody) (catalytic antibody) 或程控酶或程控酶(programmable (programmable enzyme)enzyme)，是指能够模拟酶的作用，特异性地与化学，是指能够模拟酶的作用，特异性地与化学反应的过渡态或高能中间体结合，并能够加速化学反反应的过渡态或高能中间体结合，并能够加速化学反应进行的抗体分子，通常泛指各种具有催化活

53、性的抗应进行的抗体分子，通常泛指各种具有催化活性的抗体。其本质是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其体。其本质是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。可变区赋予了酶的属性。孙利芹孙利芹2011制作制作l酶和抗体的本质区别：酶是能与反映过渡态结合的催化性物质，而酶和抗体的本质区别：酶是能与反映过渡态结合的催化性物质，而抗体是和基态分子紧密结合的物质。抗体是和基态分子紧密结合的物质。l19521952年，年，d.w.wooleyd.w.wooley推测，如果连续刺激抗体足够长时间，抗体就推测，如果连续刺激抗体足够长时间，抗体就可能进化为酶。可能进化为酶。l19691969年，年，j

54、encks jencks 根据根据panlingpanling的化学反应过渡态理论预言，如果能的化学反应过渡态理论预言，如果能找到针对某个反应过渡态的抗体，将其加入到该反应体系中，就可找到针对某个反应过渡态的抗体，将其加入到该反应体系中，就可观察到这个抗体对相应化学反应的催化效应。观察到这个抗体对相应化学反应的催化效应。l19751975年单克隆抗体制备技术的出现为抗体酶制备技术的开发铺平了年单克隆抗体制备技术的出现为抗体酶制备技术的开发铺平了道路道路l19861986年，美国加州年，美国加州l.a.lerner l.a.lerner 和和p.g.schultzp.g.schultz领导的研究

55、小组首次领导的研究小组首次同时报道了成功制备出具有催化能力的的单克隆抗体同时报道了成功制备出具有催化能力的的单克隆抗体- -催化抗体。催化抗体。抗体酶抗体酶( (催化抗体催化抗体) )概述概述孙利芹孙利芹2011制作制作lschultzschultz小组认为小组认为对硝基苯磷酰胆碱对硝基苯磷酰胆碱是相应是相应羧酸二酯羧酸二酯水解反应水解反应的过渡态类似物。用此类似物作半抗原诱导产生单克隆抗体，的过渡态类似物。用此类似物作半抗原诱导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株经过筛选找到一株mopc167mopc167，它能使水解反应速度加快，它能使水解反应速度加快1200012000倍。倍。l迄今已成功开

56、发出天然酶所催化的迄今已成功开发出天然酶所催化的6 6种酶促反应和数十种类型种酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶。的常规反应的抗体酶。l抗体酶为生物、化学和医学提供具有高度特异性的人工生物抗体酶为生物、化学和医学提供具有高度特异性的人工生物催化剂，并可根据需要使人们获得催化某些不能被酶催化或催化剂，并可根据需要使人们获得催化某些不能被酶催化或较难催化的化学反应的催化剂。较难催化的化学反应的催化剂。抗体酶抗体酶( (催化抗体催化抗体) )概述（续）概述（续）孙利芹孙利芹2011制作制作 抗体酶的研究策略，主要遵循已确立的酶催化机理，抗体酶的研究策略，主要遵循已确立的酶催化机理，即稳定过渡态、

57、酸碱催化、亲电和亲核催化、邻近效应即稳定过渡态、酸碱催化、亲电和亲核催化、邻近效应等。目前开发出的产生抗体酶的催化方法主要有：等。目前开发出的产生抗体酶的催化方法主要有：稳定过渡态法稳定过渡态法抗体与半抗原互补法抗体与半抗原互补法多底物类似物法多底物类似物法抗体结合部位修饰法抗体结合部位修饰法蛋白质工程法蛋白质工程法抗体酶制备方法抗体酶制备方法孙利芹孙利芹2011制作制作抗体酶抗体酶( (催化抗体催化抗体) )的制备原理的制备原理设计过渡态类似物设计过渡态类似物作为半抗原结合载体分子免疫动物作为半抗原结合载体分子免疫动物得到催化抗体得到催化抗体 由于以反应的由于以反应的类似物作为半抗类似物作为

58、半抗原诱导的抗体在原诱导的抗体在几何形状和电学几何形状和电学性质上与反应过性质上与反应过渡态互补，因此渡态互补，因此稳定了过渡态，稳定了过渡态，从而加速反应从而加速反应孙利芹孙利芹2011制作制作细胞融合法制备抗体酶细胞融合法制备抗体酶 用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体蛋白）偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。

59、将杂交体融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。克隆化，即能产生单一均匀的抗体。细胞工程抗体细胞工程抗体杂交瘤杂交瘤-单克隆抗体单克隆抗体孙利芹孙利芹2011制作制作同步合成型同步合成型延续合成型延续合成型 中期合成型中期合成型 滞后合成型滞后合成型 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 产酶细胞在一定的条件下进行培养产酶细胞在一定的条件下进行培养,其生长过程一般经历调其生长过程一般经历调整期、对数生长期、平衡期和衰退期。通过比较分析酶的生产整期、对数生长期、平衡期和衰退期。通过比较分析酶的生产与细胞生长的关系，可以把酶的生物合成模式分为与细胞生长的关

60、系，可以把酶的生物合成模式分为4种类型：种类型：时间时间细胞生长曲线细胞生长曲线0acbd孙利芹孙利芹2011制作制作 同步合成型同步合成型又称生长偶联型，酶的合成与菌体的生长又称生长偶联型，酶的合成与菌体的生长同步进行同步进行，也就是所，也就是所，菌体在生长的过程中，同时有酶的合成，当菌体进入对数生长菌体在生长的过程中，同时有酶的合成，当菌体进入对数生长期时，酶大量的合成，而当菌体进入平衡期后，酶的合成随着期时，酶大量的合成，而当菌体进入平衡期后，酶的合成随着停止。停止。特点：特点：其生物合成可以诱导（当有诱导物存在下其生物合成可以诱导（当有诱导物存在下 ）。但不）。但不受分解代谢物阻遏和产