06核酸化学103

1、吴吴 志志 华华 1998 南昌大学生命学院 学士 2002 福建农林大学作物学院 硕士 2006 上海交通大学生命学院 博士 2006- 中德联合研究院 副教授 食品科学与技术国家重点实验室 2010 karolinska institutet 访问学者 硕士生导师： 生物化工，食品营养与卫生学email: 第六章 核酸化学【授课学时授课学时】 3学时学时【教学内容和要求教学内容和要求】1、能画出主要的嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸的结构。2、了解dna和rna在组成、结构和功能上的差异3、掌握dna双螺旋模型的要点，以及模型在生物学上的意义4、了解几种类型rna结构特征（rrna、mrna、tr

2、na和snrna）5、 了解dna双螺旋的几种不同类型的构象存在（a、b和z构型）和环状双螺旋dna可形成超螺旋（dna的三级结构）6、了解核酸变性和复性时反映在光谱学上的变化，以及核酸分子的理化特性（增色效应，减色效应，tm，变性）【教学重点、难点教学重点、难点】（1）dna的双螺旋结构的特点和生物学意义（2）核酸分子的理化特性核核酸酸的的发发现现和和研研究究简简史史核酸占细胞干重的5-151868年被瑞士医生miescher发现，称为“核素”。在很长时间内，流行“四核苷酸假说”，认为核酸是由等量的四种核苷酸构成的，不可能有什么重要功能。1928年，格里菲斯发现肺炎双球菌的转化现象，即将活的

3、粗糙型菌和加热杀死的光滑型菌混合液注射小鼠，可致病，而二者单独注射都无致病性。这说明加热杀死的光滑型菌体内有一种物质使粗糙型菌转化为光滑型菌。第六章 核酸化学结果说明：加热杀死的结果说明：加热杀死的s s型肺炎球菌中一定有某种型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的r r型肺型肺炎球菌转化为有害的炎球菌转化为有害的s s型肺炎球菌。型肺炎球菌。这种生物分子或遗传物质是什么呢？这种生物分子或遗传物质是什么呢？1944年年oswald avery通过肺炎双球菌的转化通过肺炎双球菌的转化实验首次证明实验首次证明dna是遗是遗传物质。传物质。第

4、六章 核酸化学1953年年dna的双螺旋结构模的双螺旋结构模型建立，被认为是本世纪自然型建立，被认为是本世纪自然科学的重大突破之一。由此产科学的重大突破之一。由此产生了分子生物学、分子遗传学、生了分子生物学、分子遗传学、基因工程等学科和技术，此后基因工程等学科和技术，此后的的30年间，核酸研究共有年间，核酸研究共有15次获得诺贝尔奖，占总数的次获得诺贝尔奖，占总数的1/4，可见核酸研究在生命科，可见核酸研究在生命科学中的重要地位。学中的重要地位。第六章 核酸化学第六章 核酸化学第一节 核酸的化学组成第二节 脱氧核糖核酸第三节 核糖核酸第四节 核酸、核苷酸主要理化性质第五节 核酸的研究方法第一节

5、 核酸的化学组成 一、戊糖 二、碱基(base) 三、核苷 四、核苷酸一、戊 糖 戊糖戊糖有两种：有两种： d-核糖和核糖和d-2-脱氧核糖。脱氧核糖。 核酸分为两类：核酸分为两类：dna和和rna。 rna： d-核糖，核糖， a、g、c、u碱基，磷酸碱基，磷酸 dna： d-2-脱氧核糖，脱氧核糖， a、g、c、t碱碱 基基 ，磷酸，磷酸二、碱 基(base) 为含n的碱性杂环化合物。 分为两类：嘌呤分为两类：嘌呤（purine） 嘧啶（嘧啶（pyrimidine） 规定用三字母符号表示碱基。 腺嘌呤(adenine，ade) 鸟嘌呤(guanine，gua) 尿嘧啶(uracil，ura

6、) 胸腺嘧啶(thymine，thy) 胞嘧啶(cytosine，cyt)二、碱 基(base) 嘌呤碱嘌呤碱(purine,pu) 由嘌呤衍生而来由嘌呤衍生而来 。常见的有两种：常见的有两种： 腺嘌呤腺嘌呤(adenine，ade) 和鸟嘌呤和鸟嘌呤(guanine，gua)。 自然界中还有黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、茶叶碱、可可碱和咖啡碱。自然界中还有黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、茶叶碱、可可碱和咖啡碱。前三种是嘌呤核苷酸的代谢产物，是抗氧化剂，后三种含于植物中，前三种是嘌呤核苷酸的代谢产物，是抗氧化剂，后三种含于植物中，是黄嘌呤的甲基化衍生物，具有增强心脏功能的作用。是黄嘌呤的甲基化衍生物，具有增

7、强心脏功能的作用。二、碱 基(base) 嘧啶碱嘧啶碱（pyrimidine,py） 嘧啶的衍生物，共有三种：嘧啶的衍生物，共有三种： 尿嘧啶尿嘧啶(uracil，ura)只存在于只存在于rna中。中。 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine，thy)只存在于只存在于dna中，但在某些中，但在某些trna中也发现有极少量的胸腺嘧啶。中也发现有极少量的胸腺嘧啶。 胞嘧啶胞嘧啶(cytosine，cyt)为两类核酸所共有。为两类核酸所共有。二、碱 基(base) 稀有碱基稀有碱基 除以上五种基本的碱基以外，核酸中还有一些含量极少的除以上五种基本的碱基以外，核酸中还有一些含量极少的稀有碱基，稀有碱基，10

8、0余种。余种。 大多数是甲基化碱基。甲基化发生在核酸合成以后，对核大多数是甲基化碱基。甲基化发生在核酸合成以后，对核酸的生物学功能具有重要意义。核酸中甲基化碱基含量一酸的生物学功能具有重要意义。核酸中甲基化碱基含量一般不超过般不超过5，但，但trna中可高达中可高达10。 三、核苷与脱氧核苷三、核苷与脱氧核苷 核苷核苷是戊糖与碱基缩合而成的。是戊糖与碱基缩合而成的。 c1与与嘧啶的嘧啶的n1或或嘌呤嘌呤n9以糖苷键相以糖苷键相连，一般称为连，一般称为n-糖苷键糖苷键。 戊糖是呋喃环，戊糖是呋喃环，c1是不对称碳原子，是不对称碳原子，核酸中的核酸中的糖苷键都是糖苷键都是糖苷键糖苷键。 碱基与糖环

9、平面互相碱基与糖环平面互相垂直垂直。 糖苷的糖苷的命名命名是先说出碱基名称，再加是先说出碱基名称，再加“核苷核苷”或或“脱氧核苷脱氧核苷”。 规定用规定用单字母单字母符号表示核苷，前面加符号表示核苷，前面加d表示脱氧核苷。表示脱氧核苷。 核苷中的戊糖羟基被核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化磷酸酯化，就形成就形成核苷酸核苷酸。 生物体内游离存在的多是生物体内游离存在的多是5核核苷酸。用碱水解苷酸。用碱水解rna可得到可得到2和和3核糖核苷酸的混合物。核糖核苷酸的混合物。 核苷酸的类型核苷酸的类型dna：damp、dgmp、dcmp、dtmprna：amp、 gmp、 cmp、 ump四、四、 核苷酸核苷

10、酸四、四、 核苷酸核苷酸细胞内的游离核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物 环核苷酸 核苷5多磷酸3多磷酸化合物 核苷酸衍生物四、四、 核苷酸核苷酸 多核苷酸多核苷酸核苷5-多磷酸化合物 最常见的是5-adp和5-atp。在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。 gtp主要是作为蛋白质合成中磷酰基的供体。 utp在多糖合成中可作为携带葡萄糖的载体提供udp。 ctp在磷脂的合成中作为携带胆碱的载体cdp。四、四、 核苷酸核苷酸 多核苷酸多核苷酸核苷5多磷酸3多磷酸化合物 ppgpp pppgpp ppapp四、四、 核苷酸核苷酸 辅基类核苷酸辅基类核苷酸 辅助因子在代谢中起着非常重要的作用。辅助

11、因子在代谢中起着非常重要的作用。四、四、 核苷酸核苷酸 环化核苷酸环化核苷酸 3,5-camp， 3,5-cgmp camp激素作用的激素作用的第二信使第二信使，起信号传导作用；调节细胞，起信号传导作用；调节细胞的糖代谢、脂代谢。的糖代谢、脂代谢。 二者可被磷酸二酯酶催化水解，生成相应的二者可被磷酸二酯酶催化水解，生成相应的5-核苷酸。核苷酸。第六章 核酸化学第一节第一节 核酸的化学组成核酸的化学组成第二节第二节 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸第三节第三节 核糖核酸核糖核酸第四节第四节 核酸、核苷酸主要理化性质核酸、核苷酸主要理化性质第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法第二节第二节 脱氧核糖核

12、酸脱氧核糖核酸 一、dnadna的碱基组成和碱基摩尔百分比的碱基组成和碱基摩尔百分比 二、二、dnadna的一级结构的一级结构 三、三、dnadna的双螺旋二级结构的双螺旋二级结构 四、四、dnadna的四级结构的四级结构一、 dnadna的碱基组成和碱基摩尔百分比的碱基组成和碱基摩尔百分比 1950 1950年，年，chargaffchargaff用紫外分光光度法对碱基进行用紫外分光光度法对碱基进行分析发现，提出分析发现，提出dnadna的碱基组成（的碱基组成（chargaffchargaff定则）。定则）。即互补配对规律。即互补配对规律。 （1 1）所有生物的）所有生物的dnadna中，中

13、，a=ta=t，g=c g=c 且且a+g=c+ta+g=c+t。 （2 2） dnadna的碱基组成具有种的特异性。的碱基组成具有种的特异性。 （3 3） dnadna碱基组成没有组织和器官的特异性。碱基组成没有组织和器官的特异性。 （4 4）年龄、营养状况、环境等因素不影响）年龄、营养状况、环境等因素不影响dnadna的的 碱基组成。碱基组成。二、dna的一级结构 一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序 核酸是由(d)amp、(d)gmp、(d)cmp、(d)tmp、ump通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。即核酸的一级结构。 dnadna一级结构的表示方法一级结构的表

14、示方法结构式表示法结构式表示法结构式表示法结构式表示法结构式表示法结构式表示法字母式表示法字母式表示法线条式表示法线条式表示法三、dna的双螺旋二级结构 二级结构：dna的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。 1953年，j. watson和f. crick 在前人研究工作的基础上，根据dna纤维和dna结晶的x-衍射图谱分析及dna碱基组成的定量分析以及dna中碱基的物化数据测定，提出了著名的dna双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。dnadna双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点 （1 1）dnadna分子由两分子由两条多聚脱氧核糖核条多聚脱氧核糖核苷酸链组成。

15、两条苷酸链组成。两条链沿着同一根轴平链沿着同一根轴平行盘绕，形成行盘绕，形成右手右手双螺旋结构双螺旋结构, ,两条链两条链方向方向相反相反，即，即 一条一条链方向链方向5353，而另一条链方向为而另一条链方向为3535，螺旋结，螺旋结构上有构上有大沟和小沟。大沟和小沟。 （2 2）嘌呤碱和嘧）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的啶碱基位于螺旋的内侧内侧，磷酸和脱氧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋核糖基位于螺旋外外侧侧，彼此以，彼此以3 -5 3 -5 磷酸二酯键磷酸二酯键连接，连接，形成形成dnadna分子的骨分子的骨架。碱基环平面与架。碱基环平面与螺旋轴螺旋轴垂直垂直，糖基，糖基环平面与碱基环平环平面与碱基

16、环平面成面成9090角角。dna双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点（3 3）螺旋横截面的）螺旋横截面的直径约为直径约为2 nm2 nm，每，每条链相邻两个碱基条链相邻两个碱基平面之间的距离为平面之间的距离为0.34 nm0.34 nm，每，每1010个个核苷酸形成一个螺核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度旋旋转一圈）高度为为3.4 nm3.4 nm。dna双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点（4 4）双螺旋内部的碱基）双螺旋内部的碱基按规则配对，碱基的相按规则配对，碱基的相互结合具有严格的配对互结合具有严格的配对规律，即规律，即a- ta- t结合，结合， g g与与c

17、c结合，这种配对关结合，这种配对关系，称为系，称为碱基互补碱基互补。a a和和t t之间形成之间形成两个两个氢键，氢键，g g与与c c之间形成之间形成三个三个氢键。氢键。双螺旋的两条链是互补双螺旋的两条链是互补关系。关系。dna双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点 2 2、dnadna双螺旋结构提出的双螺旋结构提出的生物学意义生物学意义 第一次阐述了遗传信息的储存方式及第一次阐述了遗传信息的储存方式及dnadna复制的机理，以准确的语言回答了复制的机理，以准确的语言回答了dnadna是是如何成为遗传物质的。大大推动了分子生如何成为遗传物质的。大大推动了分子生物学和分子遗传学的发展，被誉为物学和分

18、子遗传学的发展，被誉为2020世纪世纪最伟大的发现之一。最伟大的发现之一。dnadna结构的多态性结构的多态性（1） b-dna：典型的：典型的watson-crick双螺旋双螺旋dna 右手双螺旋、每圈螺旋10.4个碱基对、螺距：3.32nm（2） a-dna 右手双螺旋，外形粗短。rna-rna、rna-dna杂交分子具有这种结构。（3）z-dna 左手螺旋，外形细长。天然b-dna的局部区域可以形成z-dna。（4） 三股螺旋三股螺旋dna k. hoogsteen 1963 通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(py) : oligo(pu)o

19、ligo(py/pu)第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按hoogsteen配对配对当当dna的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链（铰链dna，hinged dna , h-dna) dna三股螺旋结构常出现在dna复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或rna聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。dnadna双螺旋的稳定

20、因素双螺旋的稳定因素 dna双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。 维持这种稳定性的主要因素包括： 1）氢键 2）碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 3）离子键等 4）改变介质条件和环境温度四、dna的三级结构 三级结构：dna双链进一步折叠卷曲形成的构象。 其基本形式是超螺旋，即螺旋的螺旋。 三级结构决定于二级结构。b-dna以每10个碱基一圈盘绕时能量最低，处于伸展状态；当盘绕过多或不足时，就会出现张力，形成超螺旋。盘绕过多时形成正（右手）超螺旋，不足时为负超螺旋。 超螺旋是在双螺旋的张力下形成的，所以只有双链闭合环状dna和两端固定的线形dna才能形成超螺旋，有切口的dna不能形成超螺旋。

21、无论是真核生物的双链线形dna，还是原核生物的双链环形dna，在体内都以负超螺旋的形式存在，密度一般为100-200bp一圈。 dna形成负超螺旋是结构与功能的需要。1、环状dna的三种典型构象（1）松弛环形）松弛环形dna 线形线形dna直接环化直接环化（2）解链环形）解链环形dna 线形线形dna拧松后再环化拧松后再环化（3）正超螺旋与负超螺旋）正超螺旋与负超螺旋dna2、三种环形、三种环形dna的的拓扑学特性拓扑学特性连环数（linking number , l） dna双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（twisting number , t） dna分子中的wats

22、on-crick螺旋数目，以t表示超螺旋数（缠绕数 , writhing number , w）比连环差（specific linking difference , ） 表示dna的超螺旋程度(superhelix density) =（ll0）/l0 相当于每一圈初级螺旋（10bp，360）出现超螺旋数. l0是指松驰环形dna的l值第六章 核酸化学第一节第一节 核酸的化学组成核酸的化学组成第二节第二节 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸第三节第三节 核糖核酸核糖核酸第四节第四节 核酸、核苷酸主要理化性质核酸、核苷酸主要理化性质第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法第三节第三节 核糖核酸核糖核酸

23、一、rna的类型、分布与生物学功能 二、rna的一级结构 三、rna的构象一、rna的类型、分布与生物学功能trna 约占总rna的10-15%。它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。 一种氨基酸对应最少一种rna 分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4s左右。 分子中含有较多的修饰成分。 3-末端都具有cpcpaoh的结构。 5末端大多为pg或pc trna的功能： 转运氨基酸 识别密码子 参与翻译起始 参与dna的反转录 参与基因表达调控rrna 占细胞rna总量的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。是核糖核蛋白体的主

24、要组成部分。 rrna 的功能与蛋白质生物合成相关，可分别与 mrna、trna作用，催化肽键的形成。mrna与与hnrna 约占总rna的5%。 不同细胞的mrna的链长和分子量差异很大。 它的功能是将dna的遗传信息传递到蛋白质，指导蛋白质的合成。 真核生物mrna的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的hnrna。snrna和和asrna snrna （small nucleic rna 核小rna） 主要存于细胞核中，占细胞rna总量的0.1-1%，与蛋白质以rnp（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnrna和rrna的加工、细胞分裂和分化、协助细胞

25、内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。 asrna （antisense rna） 可通过互补序列与特定的mrna结合，抑制mrna的翻译，还可抑制dna的复制和转录。 scrna （small cytoplasmic rna）二、rna的一级结构 amp、gmp、cmp、ump通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。 rna的结构的结构特点特点组成rna的戊糖是核糖，有2-羟基，但不用于成键。rna的u替代dna中的t，此外，rna中常有一些稀有碱基。天然rna分子都是单链线形分子，可以回折，自身互补配对，形成发夹或称为茎环结构。形成局部a螺旋至少要有4-6个碱基对。某些分子中回折可占50%

26、。trna的一级结构的一级结构trna是小分子，一般由74-93个核苷酸构成，分子量在25kd上下，沉降系数4s。3末端为cca-oh。5末端大多为pg或pc。trna是修饰成分最多的核酸。三、rna的构象1、trna的二级结构1965年holley 测定ala-trna一级结构，提出三叶草二级结构模型。主要特征主要特征： 1.四臂四环； 2.氨基酸臂3端有ccaoh的共有结构； 3.d环上有二氢尿嘧啶（d）； 4.反密码环上的反密码子与mrna相互作用； 5.可变环上的核苷酸数目可以变动； 6.tc环含有t和； 7.含有修饰碱基和不变核苷酸。三、rna的构象 2、trna的三级结构的三级结构

27、 trna分子在二级结构的基 础上进一步扭曲形成确定的 三级结构。 各种trna的三级结构都象一 个倒置的l。分子的右上端是氨基酸臂，下端是反密码子。两端距离约8nm。 不同trna的精细结构不同，能被专一的氨基酸trna连接酶和有关的蛋白因子识别。 m mrnarna一级结构的特点一级结构的特点真核：单顺反子、 5 -末端有“帽子” 、 3 -末端有polya片段 和非编码区 和非编码区原核：多顺反子 5 -末端无“帽子” 、 3 -末端 无polya片段 （病毒除外） 有非编码区 有非编码区顺反子： mrna上具有翻译功能的核苷酸顺序。polya片段：指20-250个多聚腺苷酸。“帽子”结

28、构： 5-末端的g被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以5、 5-磷酸二酯键相连。三、rna的构象 真核和原核的真核和原核的mrna 1、真核、真核mrna的结构（的结构（单单顺反子）顺反子）1）5-帽子帽子：m7g 5 -ppp5-nm（ nm ）p- 功能：功能： 可能有抗核酸酶的水解；与蛋白质合成起始有关；作可能有抗核酸酶的水解；与蛋白质合成起始有关；作为为mrnamrna与核糖体与核糖体40s40s亚基结合的信号。亚基结合的信号。2）3-端端有一段约有一段约30-300核苷酸的核苷酸的polya 功能：功能： 可能有多方面功能可能有多方面功能, ,与与mrnamrna

29、从细胞核到细胞质的转移有从细胞核到细胞质的转移有关；与关；与mrnamrna的半寿期有关，新合成的的半寿期有关，新合成的rnarna其其polyapolya链较长，链较长，而衰老的而衰老的mrnamrna，polyapolya链缩短。链缩短。三、rna的构象 真核和原核的真核和原核的mrna 2、原核原核mrna的结构（的结构（多多顺反子）顺反子） 由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polya。 sd序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-aggaggu-3，位于起始密码子aug前约10核苷酸处，此序列由shine和dalgarno发现，称sd序列。 s

30、d序列和核糖体16s的rrna的3末端富含嘧啶碱基的序列互补。三、rna的构象 rrna的的结构结构 细菌：细菌：16s rrna 、5s rrna、23s rrna三者组成三者组成30s转转录单位录单位 真核：真核：18srrna、 5.8s rrna，28s rrna 三者组成三者组成45s的转录单位；的转录单位； 5s rrna单独转录。单独转录。 rrna的的功能功能： 组成核糖体组成核糖体 催化肽键形成的转移酶活性存在于催化肽键形成的转移酶活性存在于23s rrna上上 参与参与trna与与mrna的结合的结合三、rna的构象 多种rrna的一级结构已经测出。rrna只含少量修饰成分

31、，主要是甲基化核苷酸，包括m7g、m6g等修饰碱基和各种2-o-甲基修饰核苷。 同种rrna的二级结构具有共同特点。第六章 核酸化学第一节第一节 核酸的化学组成核酸的化学组成第二节第二节 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸第三节第三节 核糖核酸核糖核酸第四节第四节 核酸、核苷酸主要理化性质核酸、核苷酸主要理化性质第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法第四节第四节 核酸、核苷酸主要理化性质核酸、核苷酸主要理化性质 一 、核酸的水解 二 、一般物理性质 三 、核苷酸的解离性质 四、核酸、核苷酸的紫外吸收性质及其应用 五、核酸的变性、复性和杂交（一）（一）酸水解酸水解对酸的敏感性：嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键磷酸

32、酯键脱嘌呤：ph1.6，37，对水透析 ph2.8，100，1h脱嘧啶：98-100%甲酸，175，2h 三氟乙酸，155，60min（dna） 或 80min（rna）利用酸水解可以研究核酸的碱基组成一、核酸的水解一、核酸的水解 酸水解、碱水解、酶水解酸水解、碱水解、酶水解（二）（二） 碱水解碱水解rna的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.31mol/l koh，24h，可将rna完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。dna抗碱水解生理意义： dna更稳定 ，遗传信息。 rna是dna的信使，完成任务后迅速降解。一、核酸的水解一、核酸的水解（三）（三） 酶水解酶水解非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸

33、二酯酶水解dna（rna）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解dna（rna）得3-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶一、核酸的水解一、核酸的水解1、核酸酶的分类、核酸酶的分类底物专一性： 核糖核酸酶 rnase，脱氧核糖核酸酶 dnase作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式： 5-（寡）核苷酸，3-（寡）核苷酸 2、rnaasernase h 作用于dna-rna中的rna链牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , rnase i 最适ph ：7.0-8.2 产物

34、：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶rnase t1 耐热、耐酸 产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高rnase t2 产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸3、dnase核酸酶s1 作用于单链dna部分牛胰核糖核酸酶，dnase i 切断双链或单链dna 产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸dna限制性内切酶 限制性内切酶ii识别并切割特定的回文序列，生物体用来防止外源dna的影响，在基因工程中用于dna的切割，被称为分子手术刀。如ecori，e是属名，co是种名，r是菌株名，i是发现次序。 二、核酸的一般物理性质二、核酸的一般物理性质 dna为白色纤维状固体，rna为白色粉末状

35、固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸） dna和rna在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 dna核蛋白 rna核蛋白 0.14mol/lnacl - + 1-2mol/lnacl + -dna溶液的粘度很大，而rna溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。三、三、核苷酸的解离性质核苷酸的解离性质 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中

36、的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的ph值即为核酸的等电点pi）如dna的等电点为44.5，rna的等电点为22.5。核酸在其等电点时溶解度最小。 rna的等电点比dna低的原因，是rna分子中核糖基2-oh通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。dna没有这种作用。四、核酸、核苷酸的紫外吸收性质及其应用四、核酸、核苷酸的紫外吸收性质及其应用 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双共轭双键体系键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般，因而具有

37、独特的紫外线吸收光谱，一般在在260nm260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。分定性和定量测定的依据。 核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30-30-40%40%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增增色效应色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（有水平（减色效应减色效应）。）。 dna: a260/a280 1.8 rna: a260/a280 = 2.0 吸光度与含量的关系： 1 a = 50g/

38、ml dna 1 a = 40g/ml rna 1 a = 20g/ml 寡核苷酸 摩尔磷吸光系数: 含磷为1mol/l的核酸水溶液在260nm处的消光值，以(p)表示： a260 a260 31a260 (p)= = = cl wl wl 31六、核酸的变性、复性与杂交六、核酸的变性、复性与杂交1. 1. 核酸的变性（核酸的变性（denaturationdenaturation）的概念）的概念 核酸的变性是指核酸双螺旋区的核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂氢键断裂，变成，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷

39、酸二酯键的的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构断裂，所以它的一级结构( (碱基顺序碱基顺序) )保持不变。保持不变。 引起核酸引起核酸变性的因素变性的因素：温度升高、酸碱度改变、：温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。 判断判断dna是否变性是否变性 在dna的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在dna的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） 增色效应增色效应：变性后：变性后dnadna对对260nm260n

40、m紫外光的吸收率（紫外光的吸收率（a a260260）比）比变性前明显增加，这种现象称为增色效应变性前明显增加，这种现象称为增色效应. . 减色效应减色效应：复性后：复性后dnadna对对260nm260nm紫外光的吸收率（紫外光的吸收率（a a260260）比）比变性前明显减弱，这种现象称为减色效应变性前明显减弱，这种现象称为减色效应. .2.dna2.dna变性后的表现变性后的表现 a260值增加 粘度下降 浮力密度增大 分子量不变 用加热的方法使用加热的方法使dnadna变性叫做变性叫做热变性热变性 将将dnadna的变性达到的变性达到50%50%时，即增色效应达到一半时时，即增色效应达

41、到一半时的温度称为的温度称为dnadna的解链温度（的解链温度（melting melting temperature,tmtemperature,tm）,tm,tm也称熔解温度或也称熔解温度或dnadna的熔点。的熔点。 一般一般dnadna的的t tm m值在值在70-8570-85 c c之间。之间。rna和dna的熔解温度曲线影响影响tmtm的因素：的因素： g g和和c c的含量高，的含量高，t tm m值高值高。因而测定。因而测定tmtm值，可反映值，可反映dnadna分子中分子中g g、 c c含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算： （g+c)%=(tm-69.3)

42、x2.44g+c)%=(tm-69.3)x2.44 tmtm大小可反映出大小可反映出dnadna的均一性的均一性：均质：均质dnadna的熔解过的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质程发生在一个较小的温度范围内；异质dnadna的熔解的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。过程发生在一个较宽的温度范围内。 tmtm与介质中离子强度有关：与介质中离子强度有关：dnadna的保存应在含盐的的保存应在含盐的缓冲液中缓冲液中(g+c)% = (tm - 69.3) 2.44dna的tm与g-c含量的关系4 4、核酸的复性、核酸的复性 变性变性dnadna在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新在适

43、当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。dnadna复性后，复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。一系列物理、化学性质将得到恢复。dnadna复性的程度、速复性的程度、速率与复性过程的条件有关。率与复性过程的条件有关。 将热变性的将热变性的dnadna骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，dnadna不可能复性。但是不可能复性。但是将变性的将变性的dnadna缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越。分子量

44、越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，容易。此外，dnadna的复性也与它本身的组成和结构有关。的复性也与它本身的组成和结构有关。 复性反应的速度用复性反应的速度用cotcot1/21/2表示。表示。coco为变性为变性dnadna复性时的浓度，复性时的浓度，t t为时间，以秒表示。为时间，以秒表示。dnadna复性复性分子杂交分子杂交 变性后的单链变性后的单链dna与具有同一性序列的与具有同一性序列的dna链或链或rna分分子结合形成双链的子结合形成双链的dnadna或或dnarna杂交分子的杂交分子的过程称为过程称为杂交或分子杂交杂交或分子杂交。 分子杂交技术的发展和应用，对分子生物学

45、和生物高技术分子杂交技术的发展和应用，对分子生物学和生物高技术的发展起到了重要的推动作用。的发展起到了重要的推动作用。 1、southern blotting 2、northern blotting 3、western blottingdna 的 杂 交1、southern blotting 变性（变性（naoh 0.5mol/l） 转膜（转膜（nc膜，尼龙膜）膜，尼龙膜） 固定（固定（80，4-6h） 杂交（高盐浓度，杂交（高盐浓度，68，过夜）过夜） southern blotting可用于可用于dna之间同源性分析，确之间同源性分析，确定特异性定特异性dna序列序列的大小的大小和定位。和

46、定位。分子杂交分子杂交southern 印迹法印迹法2、northern blotting研究对象是研究对象是mrna，探针一般是，探针一般是dna。总总rna或或mrna需在变性条件下电泳（乙二醛、需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）甲醛）3、western blotting抗原与抗体的杂交抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。分子杂交分子杂交 探针探针：用放射性同位素或荧光标记的dna或rna片段。 原位杂交技术原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。 点杂交点杂交：将核酸直接点在膜上，再与

47、核酸杂交。 southern印迹法印迹法：将电泳分离后的dna片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。 northern印迹法印迹法：将电泳分离后的rna吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。第六章 核酸化学第一节第一节 核酸的化学组成核酸的化学组成第二节第二节 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸第三节第三节 核糖核酸核糖核酸第四节第四节 核酸、核苷酸主要理化性质核酸、核苷酸主要理化性质第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法第四节 核酸的研究方法一、一、 核酸的分离纯化和定量测定核酸的分离纯化和定量测定二、核酸的凝胶电泳二、核酸的凝胶电泳三、三、 核酸的序列测定核酸的序列测定四、四、 dna聚合酶链式反应聚合酶链式反应pcr五、五、 dna的重组技术的重组技术1、分离核酸的原则 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。一、一、 核酸的分离纯化和定量测定核酸的分离纯化和定量测定 真核dna以核蛋白（dnp）形式存在，dnp溶