分-子-生-物-学试验报告

1、分-子-生-物-学实验报告分子生物学实验报告2011级生物科学师范组长：组员：从甘薯中克隆ADK基因的核心片段(西南大学生命科学学院，重庆 400715)摘要：甘薯为我国农业主要栽培作物，并且是分子生物学实验室常见材料，本次实验主要 以甘薯叶片(部分为茎)为实验材料，第一次实验从材料中提取 RNA并反转录cDNA第一链， 经PCR扩增得到大量ADK基因核心片段，电泳检测胶回收 ADK基因核心片段，将其与T载 体相连并导入大肠杆菌 DH5感受态细胞中，扩增之后在加有相应抗生素的 LB平板上筛选阳 性克隆，这对后续生物信息学分析等有重要意义。第二次实验是用CTAB法提取甘薯DNAPCR扩增再凝胶电

2、泳检测纯度。(提取DNA也能扩增出ADK基因核心片段)关键词：甘薯、PCF技术、腺苷酸激酶片段(AD)基因克隆、转化Abstract: Sweet potato for my agriculturalmain cultivation crop, and is molecularbiology laboratory com mon material, this times experime nt main to sweet potatoleaves (part for stems) for experiment material, first times experiment from mate

3、rial in the extract ion RNAa nd reverse recorded cDNAfirst cha in, by PCRspread in creased get large ADK gene core fragme nts, electrophoresis detecti on rubberrecycling ADK gene core fragments, will its and t carrier connected and importEscherichia coli DH5 (feel State cell in the, spread in crease

4、d inplus hascorresponding antibioticsof LB Tablet Shang filter positiveclone This importaneeto subsequent bioinformatics analysis. The second experiment was extracted by CTAB method DNA,PCR amplificati on and gel electrophoresis and purity of sweet potato.(Extractio n of core fragme nt of DNA can be

5、 amplified ADK gene)key words: sweet potato; PCRtechnologies;Adenylate Kinase Gene( adk ); gene clone:tran sformati on1.综述1.1甘薯甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)属旋花科(Convolvulaceae) 甘薯属(Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为 2n=6x=90。其又名山芋、红芋、番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，因地区不同而有不同的名称，经济价值较高可食用也可入药世界甘薯主要产区分布在北纬 40°以南。栽培面积以亚洲最多

6、，非洲次之，美洲居第 3位。1994年世界甘薯总面积为938万公顷，总产量为12433.9万吨。甘薯是我国的主要 栽培作物，常年种植面积 6X106 hm2左右，栽培面积和总产量均居世界首位，它所富含的 淀粉是重要的轻化工和食品加工原料。选育推广优良品种是农业增产的重要措施，因此，在农业科技工作中，选育和推广优 良品种始终处于重要地位，“渝苏303”是西南师范大学在育成“渝苏1号”、“渝薯34 ”、 “渝薯20”之后，于1991年从江苏省农科院提供的杂交种籽中选育而成的又一个甘薯新品 种，原系号“ 91 一 31 一 303”，该品种（系）19941995年参加四川省甘薯新品种区域试 验，19

7、97年5月、1998年1月和1999年4月分别通过四川省、重庆市、江苏省农作物 品种审定委员会审定，1998年该品种在重庆、四川、江西、江苏、贵州、河南等省市 的种植面积在1X 104hm2以上。经过较长较深时间的研究，甘薯应经成为西南大学生命科 学学院分子生物学实验室的常用材料，从分子生物学角度对其进行基因水平上的实验研究 对于提高甘薯的质量和产量都有重大意义。1.2 ADK基因腺苷酸激酶（EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK是生物体内普遍存在的一种单体酶， 广泛存在于生命有机体中（如微生物、植物和动物体内）。腺苷酸激酶（ADK催化ATP和AMP合成两分子ADP

8、的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配 的关键酶。其表达量直接影响腺苷酸在糖类代谢库和核酸代谢库中的分配。生物信息学分 析表明，在淀粉合成水平最高的植物中，腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最 高，因此，作为腺苷酸代谢库调节中枢的 ADK基因（adk）是淀粉代谢工程的重要候选基因， 将该基因表达量控制在较低水平就可打破腺苷酸代谢库的平衡，使腺苷酸代谢流向淀粉合成的方向流动。用基因工程技术获得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物，为实现淀粉代谢工程奠定了基础。IbADK全长1314bp,其 编码区长度为855bp,编码长度为284

9、个氨基酸残基的ADK蛋白（IbADK）;生物信息学预测 IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。1.3研究目的和意义本次试验就是利用从甘薯“渝苏 303”中提取ADK目的基因，通过连接制备重组 DNA 然后导入到大肠杆菌细胞中，通过筛选检测目的基因是否转化成功。本次实验涉及甘薯总 RNA的提取，反转录成cDNA第一链过程，PCRT增目的基因及检测，目的基因回收与连接， 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，连接产物的转化筛选和 PCF检测，以及选做实验植物DNA 的提取及检测。原理上根据目的基因的制备，重组DNA分子的构建，重组DNA分子转移到受体细胞，转化子的筛选，和目的基因表达与

10、功能的鉴定的操作步骤，从分子层面直观的 告诉我们了基因工程技术中的操作方法和实现手段。腺苷酸激酶(ADK)在维持细胞能量平衡中起着重要作用,也就对农作物的产量的提升 具有很大的重要作用，不仅是在农作物光合作用的效率的提升上，也在像甘薯这样积累淀 粉的农作物的生产量的提高上面具有很大的作用。弄清楚了甘薯中的ADK基因的序列，对于有征对性的提高甘薯的产量具有直接的关系。2. 材料与方法2.1材料2.1.1实验材料：甘薯叶片2.1.2 实验工具PCRT增仪，电泳仪，恒温培养箱1台，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床2台，离心机1 台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶3X 10个，室内使用的大中型枪头各

11、1盒，两 面板(蓝板)1个，室内使用的1.5mL的EP管1套。涂布器1根，凝胶成像系统1台，一 次性PE手套，研钵、杵、药勺1套。2.1.3实验试剂裂解液RZ氯仿，无水乙醇，蛋白液RD漂洗液RW，oading buffer , Super Pure dNTPS, RNase-FreeddH2O,buffer,RNasi n,TIANScriptM-MLV, MiniQ H2O,10 X PCRbuffer,MgCI2,dNTPmix, 引物 1,引物 2，Taq,琼脂糖，TAE, Gold View ,B -巯基乙醇， 平衡液 BL，PN缓冲液 EB,PMD-19Vector, Insert

12、DNA,Solution I, CATB液氮，异丙醇， 乙醇，CaCl2, LB液体培养基，Amp抗生素，IB固体培养基2.2方法2.2.1植物RNA的提取及检测及反转录植物RNA勺提取实验方法参见总RNA提取试剂盒说明书。反转录过程如下：1. 在离心管中加入 2 ul RNA 2 ul 引物，2 ul Super Pure Dntps,8.5 ul RNase-Free ddH202.70 C水浴加热5分钟后，冰上冷却2分钟，再进行简短离心3.加入 4 ul Buffer ，0.5 ul RNasin4.力卩1 ul TIANScript M-MLV,轻轻用移液器混匀注意事项如下:1. 第一

13、次离心过后，吸取上清液 400 ul另一离心管中，呈淡粉色。2. 共经过7次离心，均为常温离心，每次离心后加入的试剂不同，需细心。3.简短离心的步骤与正常离心不同，控制时间2.2.2 PCR扩增adk基因核心片段(1)在2个50ul的PCR反应管中依次加入如下组分：PCF反应体系:39.52)10 x PCR buffer(含Mg离子)1)Mi niQH2O3)10mM dNTP mix4)引物 1(10 卩 M) F-ADK5)引物 2(10 卩 M) R-ADK)Taq(2 to 5 units/ul)7)模板(DNA)0.5总体积50.0(2)短暂离心混匀各组分后，将PCF反应管放入PC

14、F仪。1min(33个循环)PCR反应的程序如下：I)94 C4mi nII)94 C45s ;in)72 C8minIV)4C保存56 C 45s;72 C(3)将PCR物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果223胶回收adk基因片段和连接T载体及大肠杆菌的培养1)胶回收adk基因片段按照提供的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒一-离心柱型中所述的方法对已检测并可使用的adk基因片段进行回收1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm(13400X g)离丿钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下

15、放入干净的离心管中，称取重量。3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN因为凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul 类推。50 r水浴放置10分钟，期间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。，以此4. 将上一步所得溶液加入另一个吸附柱CA2中室温放置2分钟，12000rpm (1g)离心3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2放入收集管中。5. 向吸附柱 CA2中加入700ul漂洗液PW 12000rpm (13400X g)离心3060 掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2放入收集管中。3400X秒，倒6.向吸附柱 CA2中加入500ul漂洗液PVy 12000rpm (13400X

16、 g)离心3060掉收集管中的废液。秒，倒7.将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm (13400X g)离心2分钟，尽量出去漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干。8.将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗j脱缓冲液EB 水浴37C2分钟。12000rpm (13400X g)离心2分钟收集DNA溶液。2)连接T载体1.在200ulEP管中加入下列组分:PMD-19TVector0.5ulIn sert DNA4.5ulSolution I5 ul2.轻轻混匀，16C连接30分钟 3)大肠杆菌摇床培养部分同学在老师指导下已完成2.2.4 D

17、NA的提取及大肠杆菌感受态细胞的制备1 ) DNA的提取1、向10ml离心管中预先加入4mlCTABt提液及相应量的B -巯基乙醇(2%-3%, 65C预热；2 、取适量的植物甘薯嫩叶用液氮充分磨成粉末，转入该10ml离心管中，迅速混匀。3、于65E水浴45min,中途间隔(轻柔)颠倒混匀三次或四次；4、冷至室温后加入等体积(4ml)氯仿，轻柔颠倒混匀使乳化10min;5、10000转/分离心 10min (18-20 C)；&吸取上清3-4ml于另一干净的10ml离心管中；157、吸取上清加入与上清液等体积且已于-20 C预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 分钟至白色絮状沉淀出现；8、

18、 用玻璃钩子挑出 DNA放入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml Eppendof 管中9、用75%L醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；10、用1ml 75%乙醇再漂洗一次；11、用无水乙醇再漂洗一次；12、沉淀于室温或60C以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；13、用500卩l TE溶解沉淀，可用65C水浴助溶，得DNAE提物。14、取10卩l DNA电泳检查DNA的质量；2)大肠杆菌感受态细胞的制备1. 将1ml过夜培养菌液移入 50mlLB培养基中，37C震荡培养至 0D值为0.3-0.62. 取培养液3 ml转入10ml无菌离心管中，于 4°C 4000r/min离心1

19、0min，去上清3. 沉淀用3ml预冷的0.1MCaCI2悬浮，与冰上放置30分钟；4. 4 C，4000r/min离心 10min,去上清；5. 沉淀用600卩l冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞6. 分装3管，每管200卩l ，冰上放置30分钟2.2.5连接产物的转化、筛选及 PCF检测1.将10卩l DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；2.42 C水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上 2min，室温下放置3-5mn ；3. 加入800 l 37 C预热的LB液体培养基，混匀后 37C 180 rpm 培养0.5h4.4000 rpm 离

20、心10min，去800 l上清液，将剩余的 200 l菌液混匀；5. 用烧烤过的涂布棒将100 l的菌液涂布于加相应抗生素的 LB固体培养基涂匀，共6. 置于37 C恒温箱中培养226连接产物的筛选及PCR佥测1. 选取平板上合适菌落，标记备用（共 4个）2. 用10卩l移液器枪头对准所选菌落刮取，置于装有1ml溶液的EP管中3. 将EP管进行摇床培养4. PCF检测3. 实验结果与分析3.1甘薯RNA的提取及检测+反转录msu 12345628 Sf 工18 S-* 图1-1 总RNA勺电泳图（初）图1-2 总RNA的电泳图（末）5.8 A结果分析：RNA极易被RNA酶降解，而RNA酶在自然

21、界中广泛而丰富的存在， 因此要取得本次实验的成功关键之处在于严格防止RNA酶的污染。此外，为了达到更佳的效果，实验选用的材料是甘薯嫩叶，因为其RNA含量丰富，但实验中能否研磨充分，也会对实验结果造成影响。从RNA电泳的结果来看，我们组在该次实验中较好地做到了这两点，因此获得的条带不仅区分度好，亮度也高。在实验中共进行了两次紫外检测，首次检测是在预期时间后，但发现RNA条带跑的不是很开（如图1-1），分析原因是配制琼脂糖凝胶时胶浓度比期望浓度大， 致使RNA迁移速率减慢，因而电泳时间相对延长。由于在电场中核酸分子的迁 移速率取决于分子量大小和空间构型，沉降系数大的RNA跑得慢，故从上到下的条带分

22、别代表28S、18S、5.8S （如图1-2）。从电泳获得的28S和18S两条主 带的亮度来看，28S和18S RNA比值约为2:1，符合一般真核细胞 RNA比值。3.2PCR扩增adk基因核心片段图2 PCR扩增adk基因的电泳图结果分析：上次实验中，我们对获得的甘薯RNA进行了反转录，获得cDNA。本次实验利用上次实验获得的 cDNA进行PCR，所用的10X PCR buffer、taq 是北京普博欣公司生产，而引物1、引物2系华大公司生产（1、2组），其他四 组用其他公司生产的试剂盒。从扩增结果来看，效果均不错（1-4组扩增的是adk 基因，5、6组扩增的是adk核心片段，故结果有所差异

23、）。通过与Marker跑出 的条带对比，扩增的目的基因在 1000750 bp之间（Marker各条带从上到下分 别表示2000、1000 750、500、250、100,后面3个不太明显）。本次实验每个组共做了 2个50让反应体系，但待加完所有试剂后，很多体系的 体积明显不同，分析原因可能是在操作过程中使用移液枪出现问题，或是移液 枪本身有误差。3.3目的基因片段的回收、连接上次实验我们扩增到了甘薯adk目的基因，并进行了电泳，得到了单一目的DNA 条带，本次实验将该目的DNA条带切下，进行胶回收和T载体连接。实验进行 顺利。根据时间安排，本次连接过夜，是连接更加完全3.4DNA的提取、大肠

24、杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化3.4.1DNA的提取图4-1 提取DNA吉果图图4-2 提取DNA的电泳图结果分析：本次提取DNA使用的材料仍是甘薯，所用植物材料的量和研磨是否 充分是影响获得 DNA量多少的两个主要方面，与其他组相比，我们组提取的 DNA量比较充足（如图4-1所示）。将此DNA沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳， 得到3条清晰可区分的带，从上向下依次代表蛋白质等大分子杂质、DNA、RNA （如图4-2所示），较其他组而言，我们组 DNA条带亮度高，说明提取的 DNA 量多。RNA分带不明显，说明有部分降解，但未被降解完全。3.5连接产物的筛选及PCR检测结果分析：我们组的两个

25、加了氨苄抗生素的 LB培养基上共长出了 4个大肠杆菌 菌落（分给了 2组一个），这几个菌落形状都比较规则，判断是由一个大肠杆菌 长成，由于它们能够在加了氨苄抗生素的培养基上长出，说明它们具有氨苄抗 性，说明有T载体导入，但无法确认该 T载体上是否有我们所需的adk目的基 因，还需进一步菌检。由PCR菌检结果可知（如图5-2），该3个菌落虽都是转化子，但3号菌落菌检 无条带，说明3号菌落是假阳性的，而1、2号菌落则是我们所要得到的菌落 整个分子实验取得成功。取得这样的结果，有一部分运气在里面，但全组成员 在此过程中的严谨操作也是必不可少的重要因素分子生物学实验感想四天的分子实验结束了，时间看似漫

26、长，却也如此短暂，回首这 四天的实验经历，有辛苦，有疲惫，但也不乏成就感和喜悦感，在老 师的指导下，和同学们一起完成实验，这样的过程总是那样美好，让 人留恋，当然，实验过程中收获到的心得体会对于我来说最为宝贵。作为我们一组的记录员，说实话，工作有些辛苦，但是我觉得很 快乐，这份工作很适合我，也正是我喜欢与擅长的方面。从实验当初 的迷茫，到实验最后的娴熟，我也不得不佩服自己的耐心与细心， 这 是我以前没有发现的优点，希望以后可以得以施展和加强巩固。由于做记录员，工作比较繁杂，所以实验中我只做些简单的操作， 比如离心、计时等，但对于整个实验流程我还是比较了解的， 这也是 记录员的好处吧！在这方面我

27、的收获还是蛮大的，至少懂得实验过程 是马虎不得的，有一步失误，就可能导致整个实验的失败。我们组在整个实验过程中都很顺利， 包括后面对菌的培养，长出 了四组明显菌落，并且发现了 2个阳性转化子，这种结果是我们期待 的，同样也是我们没有想到的，心里别提有多开心了，感觉这四天的 努力没有白费，一切辛苦都是值得的。以上所说的都是我在实验中的体会，接下来我想说的是实验过后 我的感想，这些感想比实验中那些匆匆的心情增加了许多反思与积 淀。给我留下最深印象的应该是周四那天晚上，也就是实验结束，曾老师在讲台上给我们讲了一些事情的那堂晚课， 记得当时实验结果还 没出来，曾老师给我们讲实验报告该怎么书写， 其中提

28、到了实验结果 的问题，曾老师说“实验失败了并不可怕，这很正常，不要被这件事 影响了心情”，之后又举了很多他经历的实验失败，告诉我们要学会 总结和反思，说实话，有那么一大段时间我都是眼含泪花地听着他讲 话，不时地笑一下回应，心里很温暖，他真的是个好老师，懂得怎么 教育学生，很多老师都会采用批评的口吻总结课堂， 那样的方式我们 早就厌倦了，而他却用不同的方式告诉了我们真理，这让我很感动， 也很崇拜，即使失败，老师也还在关照着我们的内心，那份感谢不知 怎样用语言来表达，我想我会永远地记得他的教育方式， 来教育我的 学生，用那份宽容来对待我身边的人。曾老师让我们对他提一些建议， 我只想提一点：希望您继

29、续温暖 可爱的孩子们，用您一直宽容的心对待您的学生们！实验过程中，有老师帮助，同学的团结，有工具、药剂的陪伴， 我感到很幸福，很充实，认真对待每一件事，每一个人，正确看待自 己，定位未来的道路，相信明天会更好。分子生物学实验感想本次实验我们做了 RNA的抽提与检测、RNA逆转录获取cDNA 及检测、PCR扩增目的的基因及检测、目的基因片段的回收与连接、 大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化和筛选及PCR的检测及DNA的抽提与检测。此次为期大概四天，实验中小组成员都想积 极参与，但由于实验不需要太多人动手，部分人不得不只配和其他组 员完成任务。本次实验成功不仅仅是小组成员间的合作成果， 也是

30、全 班各小组共同合作的成果。充分体现了实验需要团队合作。我们充分 利用时间自觉完成实验，相对而言效率较高，实验结果较为成功。经过四天的实验，我们把 DNA,RNA的提取，PCR扩增目的基 因，电泳，胶回收目的片段，连接一T载体，转化大肠杆菌，阳性克 隆筛选，PCR鉴定连起来做，感觉能把整个实验串联起来，更有利 于实验知识的学习，这几天实验做下来心里很踏实，老师要求写的实 验报告很特殊，我们小组合作的方式完成实验报告， 对实验知识有进 一步的加深。思路得到了开阔。实验过程中，我们把看不见的DNA提取出来了，也得到了 PCR 等的实验结果。在理论中很难理解的东西，实验后理解起来更容易了。 经过曾令

31、江老师的指导，实验中反复操作后，我们对实验仪器使用技 术提高了。此次分子生物学实验采取集中时间按技术路线流程完成， 不仅节约时间，更是让我们更深入的熟悉理解技术操作原理。 相比于 其他科目的实验，每周进行一小部分实验操作，没有很好地连接起来， 分子生物学实验更利于我们记忆，效率明显的有大部分提高。再加上 曾老师的悉心指导及包容，帮助我们从失败的结果中得出的经验及教 训，改正错误。从老师身上我们也学到了细心，耐心，坚持不懈的实 验精神。这次试验老师才是最辛苦的人。实验中我们收获了很多，不但获得了实验的相关知识，让我们近 距离更直观的理解了课本上的理论知识，也让我们加强了实验的操作技能，更加注意实

32、验的相关事项。实验中要十分严谨并且要积极观察 相关现象。另外，有点小遗憾就是实验中人数太多了，器材不够，很 多同学没有真正的参与到实验的具体操作中来最后，感谢曾令江老师对本次实验悉心指导与帮助。古丽克孜吐热克分子生物学实验总结与体会从5月12日开始到5月15日持续四天没有严格作息时间的分子生物学实验，也是大学里最后的一门实验课结束了，反而有一点失落, 不再整天那么忙碌，不习惯了。实验中同学们都和积极，每节课都能全勤，并且参与实验，这一门实 验课是我大三学年上的最实在的实验课， 跟有的实验是不一样的，老 师全程陪同、指导，有一个基本思路，技术路线，使得实验不再那么 茫然，不会给一堆新鲜的实验仪器

33、， PPTI浏览一遍然后就把实验室 扔给我们，最后只要交实验报告就行了。在本次实验中，我体会到了1、实验以人为本，科研都是为人服务的，虽然科研工作者都要有为科研献身的精神，但还是要在实验中采取措施保护工作者，以免去不必要的人身损失，就比如在用液氮里研磨甘薯叶片，操作者都要用棉手套和一次性塑料手套，防止冻伤； DNA提取中，研 磨得到的植物组织粉末和经65摄氏度预热的试剂温差太大，加入 粉末是，离心管口要朝无人的地方；电泳制胶，染色剂用了 GV 来替代强致癌剂EB等。2、实验在不影响实验结果时要节约资金，做了这么多次实验分子 生物学实验室我首次见到了好几个量筒上半部分无刻度的部分损 坏但仍然坚守

34、岗位，还在用于实验，尽管这只是几只量筒，足以 表现出实验室管理者节约的原则。3、小组实验重于合作，本次实验我们组虽然全是女生，但是在大家合理分工相互合作下，实验还是取得了成功，最后挑出的三个菌落，有两个都是阳性转化体。并且在两个实验第一步研磨植物 组织，我们组都率先高质量完成。4、作为师范生，我从曾老师身上学到了要适时给予学生鼓励，在第二个实验。连接产物转化步骤后，培养皿置于恒温培养箱中7摄氏度培养12到14小时，再去挑菌落筛选的时候，有两个组培 养皿中一个菌落也没有，然后就从其他组挑取单菌落继续实验， 但后续过程中扔不忘去关心一下自己组的培养基中有没有再长出 菌落，老师说了一番话让人心里暖暖

35、的，给予了大家鼓励，老师 说他们起码是关心本次实验的，实验失败很正常，只要下去思考 了失败的原因可能比实验成功的同学收获更多，一次实验的成功 与否与运气也有一点点关系5、制胶、点样、感受态细胞的制备、挑菌落、配PCR反应体系等等步骤一个也不能马虎，在第二次实验点样用以跑电泳筛选阳 性转化体时，我点第三个孔有点抖，差点把孔捅破，因为前两个 加10微升，都从孔里浸出来了，实验技能有待提高。另外反应体 系的制备是不能想当然的，用的不同产品，配方、浓度不同加的 体积也不一样，需要慎重，自己计算。建议：实验的每一步操作需要的人并不多， 这样的分组使得一部分同 学不能很好的参与进来，因此个人建议 3人左右

36、为一组。分子生物学实验总结与体会2014年5月12日，我们班的分子生物学开始动手做了。我们先 对本门课程的实验进行了一个初步的认识：以甘薯叶片为实验材料， 首先进行甘薯的总RNA的提取，反转录成cDNA第一链，PCR扩 增ADK基因核心片段，电泳检测胶回收 ADK基因片段，然后将目 的基因ADK与T载体连接，并转化大肠杆菌DH5a ,随后进行PCR 的检测筛选阳性转化子，后续的还有测序及生物信息的分析等就不需 要我们做了。有了初步的认识和技术流程的熟悉后， 我们下午就开始 了实验。第一天实验做了甘薯RNA的提取和反转录成cDNA第一链。这 是第一次做关于分子生物的实验， 老师讲了原理和注意事项

37、之后，整 个实验在进行过程中都非常的安静。以后的实验上老师对我们的要求 也很严格，所以最后我们每个组基本上都有了结果。当然从效果上看， 我们组的效果是最好的：我们挑了三个菌落进行检测，实验结果出来 我们有两个是阳性的。在本次实验中我收获的东西不仅仅是实验结果， 收获更多的是实 验时的一些操作方法（如 PCR技术、凝胶的配制等）和与伙伴们的 协调配合，还有对实验结果的分析等（如果一次实验失败了，懂得如 何分析出失败的原因）。通过本实验，让我真正地清楚了克隆 ADK 基因的核心片段整个操作流程，记住了很多主要步骤的原理。当然，有收获也有遗憾的地方，比如：1在实验过程中我容易出现“照方抓药”的情况，自己并不完全 的明白我所做的这一个步骤有什么作用，就跟着实验指导上的步骤跟 着做了，缺乏了很多的思考。所以在今后的学习中，希望自己能多学 会思考所做的每一步有什么意义。2.实验分组中每个组的人太多，每个组都有 5个人或以上，但是