实用pcr流程表知识讲解

1、实 用 pc r 流 程 表精品资料临床PCR检验流程记录表检验日期:检验项目：HBV-DNA扩增仪中保存文件名使用说明：严格按单一流向进行实验，即试剂准备区-标本制备区-扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项工作执行后在相应项目前的方框内打“V”；本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）生物安全柜的滤膜在使用有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酉精，即用即 配。打开通风

2、设备操作者仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢5试剂准备区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（28C）C； 冷冻室（-20 ±2C）C实验室温度C （允许范围：1530C）;相对湿度：（允许范围：30%70%PCR式剂来源： 试剂厂家：口 深圳匹基生物工程有限公司 批号：检验项目： HBV-DNA人份本次实验用量：人份；剩余量：其他有关试剂配制:仪器设备使用：离心机：正常不止常 ;振荡器： 止常不止常；生物安全柜： 口正常口不正常实验后：按实验室清洁消毒SOP青洁实验室台面、地面、加样器和离心

3、机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。操作者检验日期：检验项目：HBV-DNA样本处理区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（28C）C； 冷冻室（-20 ±2C）C实验室温度C （允许范围：1530C）;相对湿度：（允许范围：30%70%HBV-DNA0性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置:917-25-33-41-495765173-8189210

4、18263442505866748290T735-51 -596758391 ""412202836445260681 768492-5T321 "29-37"45-53691 778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。仪器设备使用： 生物安全柜： 正常不正常； 恒温金属浴： C；离心机： 正常 不正常； 振荡器： 正常 不正常；低温离心机：制冷：正常不正常； 离心：正常不正

5、常实验后：按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。口使用后标本冷冻保存3个月，以备复查。操作者检验日期： 检验项目：HBV-DNA扩增及产物分析区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）实验室温度C （允许范围：1530C）;相对湿度： （允许范围：30%-70%LightCycler扩增仪操作：开机自检及运行正常；按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定HBV-DNA标准曲线计算值：Slope值： Intercept值： r2

6、值：室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控 SOP进行）实验结果：见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断：有效无效（依据实验结果有效性判断 SOP进行）实验后：按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射 30分钟以上。按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。操作者1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照

7、+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各 200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.2.5 56摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡 15秒）。在室温下静置5分钟 （15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过 25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时 离心，以去除管盖上的滴液。1.2.7将

8、n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。盖上盖子，6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收 集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确 保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul洗液1,盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul洗液2,盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。精品资料1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul无

9、水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1 分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。1.2.11 20000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子，56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。1.213将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入 60ul 洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在 2小 时内用于PCR扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。2. 扩增试剂准备（PCR前准

10、备区）从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、Enzyme Mix ,在室温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n （n二样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准 品），每个测试反应体系配制如下表：试剂HCV RT-PCR反应液En zyme Mix用量n *13uln *2ul计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。3. 加样（样本处理区）吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及

11、HCV定量标准品分别加入 到上述反应管中（空白对照直接加入 10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同 Roche 专用金属反应管套放在离心机中，于 2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。4. RT-PCR反应（检测区）4.1循环条件设置ProgramCyclesTemperature摄氏度In cubati on Time(mi n:sec)Temperatur eTran siti on Rate( 摄氏 度 /sec)Acquisitio n ModeAnal ysis Mod e115030:0020NoneNone21951

12、5:0020NoneNone3459500:0520NoneQua ntifi catio n5000:3020Si ngle7200:2010None反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书4.2仪器检测通道选择选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。4.3样本的设定在扩增开始前条件设定时，将 HCV定量标准品设为“Standard ”并输入试剂盒内给 定浓度值，待检样本和对照品设定为“ Unknown ”。结果分析条件设定1. 对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择 Arithmetic,阈

13、值（threshold ）设定原则以 阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常 HCV阴性对照病毒滴 度为O.OIU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以 HCV定量标准品的浓度值为横 坐标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值 应大于等于0.980,四个HCV定量标准品的Ct值都应38.0，否则视为定量结果无 效。2. HCV阴性对照、空白对照 HCV RNA应为0.0IU/ml ； HCV强阳性对照HCV RNA应 为 5.0E+05-1.0E+07IU/m I ； HCV

14、 临界阳性对照应为 1.0E+03-1.0E+05 IU/ml ;且 HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于 33,否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA 小于等于5.0E+07 IU/ml，测定结果 有效，可直接报告相应的浓度值。2. 检测样本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度， 亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新 测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。3. 检测样本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml，且HCV内对照（IC ）的 Ct值都应小于等于33，表明病毒载量较低，可直接报