5第五章核酸化学

1、第第 五五 章章 核核 酸酸第一节 概述 p177n一、核酸研究简史n（一）核酸的发现n1868年瑞士青年科学家miescher在外科绷带脓细胞分离得到细胞核，从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物称为核素。n1889年altmann发明了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法。首次提出了核酸的名称。（二）核酸功能的发现n1944年,avery的肺炎球菌转化现象证明了遗传的物质基础是核酸（三）（三）dna双螺旋结构模型结构的建立nx-射线结晶学技术的进步导致1953年 watson和crick提出dna双螺旋结构模型。1958年提出中心法则。n19661966年年nirenbergnire

2、nberg破译了遗传密码破译了遗传密码dna双螺旋立体结构两条两条dna链形成双螺旋结构链形成双螺旋结构 the two strands of dna form a double helix. 1958 crick提出中心法则（四）生物技术的兴起n七十年代前期dna重组技术的建立的基础导致现代生物技术的兴起。 （五）人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元n1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划，在经过各国科学家的多年努力，已取得巨大的成就。n人类基因组的全序列提前到2003、4、14完成。n生命科学已进入了后基因组时代，研究重心已从基因测序转移到基因的功能。n 功能基因组学n 蛋白质组

3、学n 结构基因组学n rna组学二 核酸的概念和重要性n( (一一) )概念概念n核酸是由许多核苷酸单元按一定顺序连接组成的核酸是由许多核苷酸单元按一定顺序连接组成的线性多聚体，是核蛋白的组分之一，呈酸性，最线性多聚体，是核蛋白的组分之一，呈酸性，最初从细胞核中发现，所以称核酸。核酸是所有生初从细胞核中发现，所以称核酸。核酸是所有生物遗传变异的物质基础。物遗传变异的物质基础。n( (二二) )重要性重要性1.1.与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。2.2.核酸研究是现

4、代生命科学研究的核心核酸研究是现代生命科学研究的核心。n第二节 核酸的类别、分布和组成n（一）、类别：p178n核酸分为脱氧核糖核酸（dna）、核糖核酸（rna）。n核糖核酸（rna）分成三类： 1、信使rna（mrna） 2、转移rna（trna） 3、核糖体rna（rrna）n（二）、分布： p178n1、dna的分布： 原核生物集中于核区. 真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有dna. 原核、真核生物的质粒 病毒含有dna或rna. n2、rna的分布 存在于细胞质和细胞核中。 发现了许多新的具有特殊功能的rna： 如反义rna，核酶等. 病毒和亚病毒rna有许多种：正链rna病毒、负链

5、rna病毒、类病毒、卫星病毒等 .（三）、组成 p178n1.组成元素:c 、 h 、 o 、 n 、 pn2.组成单位:核苷酸 核酸水解产物：核酸水解产物：n（1）碱基： p179a、嘌呤碱：腺嘌呤（ade)、鸟嘌呤(gua)b、嘧啶碱：胞嘧啶(cyt)、尿嘧啶(ura)、胸腺嘧啶(thy)c、稀有碱基: 稀有碱基大部分都是甲基化碱基 trna稀有碱基约占10%rna为d-核糖，dna为 d-2-脱氧核糖，二者都是 型。差别：2 位羟基是否脱氧。（2）核酸中的糖 p180嘌呤碱基和嘧啶碱基 p179 n（3）核苷：p180n戊糖与碱基通过-糖苷键相连，cn糖苷键。n糖c1与嘧啶碱n1与嘌呤碱

6、n9相连，碱基与糖环垂直。n根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。n命名先冠以碱基名称，糖环c加，碱基不加。n核苷的顺式结构和反式结构。n rna某些修饰化和异构化的核苷 ，碱基、核糖均可被修饰，主要是甲基化。ntrna 、 rrna还含有少量假尿嘧啶核苷。核苷n（4）核苷酸 p181n戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。n核糖核苷糖环上有3个自由羟基。n脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。n环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。 碱基相连（核苷）酯键核苷酸dna与rna的化学成分腺腺嘌嘌呤呤 a鸟鸟嘌嘌呤呤 g胞胞嘧嘧啶啶 c尿尿嘧嘧啶啶 u胸胸腺腺嘧嘧啶啶 trna ampgmpc

7、mpump未未发发现现dnadampdgmpdcmp未未发发现现dtmp第三节 核酸的结构 p186n一、核酸的一级结构 p186n（一）核酸中核苷酸的连接方式ndna、rna中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3，5 磷酸二酯键连接的。n表示方法：书写顺序53。n核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。核苷酸的组成与连接1、表示方法n（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸pp5335pp53p53acgtn（2）文字式：n5ppppppppp3dna5ppppppppp3rnan此式可进一步简化为：n5 3 5 3n(二）dnan1、dna的一级结构 p186n

8、dna的一级结构a、t、g、c通过3，5-磷酸二酯键连接，c1碱基，c2脱氧。n碱基：a、t、g、cn脱氧核糖n没有侧链dna的一级结构图示2 、一级结构特点n dna的相对分子量非常大，能编码的信息量十分巨大。n细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因，组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。n真核生物的基因是断开的，有内含子功能相关基因，不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重复、中度重复、单一序列。此外还有回文结构.n越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。内含子基因内不编码任何蛋白质和rna的顺序，又称为插入顺序（基因与基因之间非编码顺序称为间隔顺序）

9、。操纵子dna分子中基因表达的一个协调单位。重复顺序dna中许多重复排列的核苷酸序列。高度重复顺序“基础顺序”短，含5-100pb,重复106-107次。中度重复顺序“基础顺序”长，含100-300pb或更长,重复几百到几万次。单一顺序单拷贝。大小不等，每一段顺序决定一个蛋白质结构，为一个蛋白基因，称为结构基因。回文结构该结构中脱氧核苷酸的排列在dna两条链中顺读与倒读其意义是一样的。相关概念回文结构及其形成的发夹结构和十字架结构回文结构及其形成的发夹结构和十字架结构n附：一级结构的测定n原理:末端终止法 化学法 dna测序仪n（1）末端终止法：（2）化学法n硫酸二甲酯使g和a甲基化后，g的糖

10、苷键更容易断裂，甲酸替代硫酸二甲酯后，都断裂；食盐存在时，肼专门断裂c，无食盐存在时，c和t都断裂。n3、二级结构n（1）、模型建立的依据：p187na chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的dna的碱基组成。结果显示：n摩尔数：a=t；g=c；a+c=g+t； a+g=c+tnb、dna钠盐纤维x -衍射分析：34a3.4aantiparallelmajor grooveminor groove20a34andna结构模型 dna结构模型n（2）、）、dna双螺旋的结构特征： p187na、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋； nb、骨架：内侧碱基垂直于纵

11、轴；n外侧磷酸与戊糖、彼此通过3、5磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。n大沟宽1.2nm，深0.85nm；n小沟宽0.6nm，深0.75nm；nc、直径：2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度，旋转一周度，旋转一周10个个核苷酸，一周高度3.4nm；nd、碱基互补配对：a、t形成两个氢键；g c形成三个氢键，碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。腺嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶碱基之间形成氢键模型碱基之间形成氢键模型双螺旋平面图the double helix maintains a constant width because purines always

12、face pyrimidines in the complementary a-t and g-c base pairs. the sequence in the figure is t-a, c-g, a-t, g-c.碱基平面垂直于糖碱基平面垂直于糖- -磷酸骨架磷酸骨架flat base pairs lie flat base pairs lie perpendicular to perpendicular to the sugar-the sugar-phosphate phosphate backbone.backbone. n5、 dna二级结构的多态性二级结构的多态性 p190n

13、dna分子结构可受环境的影响而改变分子结构可受环境的影响而改变nb型dna：在相对湿度92% 下制得的纤维是b型结构，适中。na型dna：在相对湿度75%下制得的纤维是a型结构，宽短。nz型dna：碱基与中心的倾角9，细，细长。长。dna的构型n三链dna. 人工合成dna发现，第三股嵌在大沟里。n四链dnap191三链dna结构n6、三级结构：p193n细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。n超螺旋，三级结构中的一种。ndna压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。dna超螺旋结构叶绿体中含有环状dna细菌等原核生物细菌等原核生物线粒体中含有环状dna原核、真

14、核生物环状dna超螺旋三级结构n（三）（三）rnan1、rna结构的特点结构的特点 p195 rna与与dna结构十分相似，二者相比有几点不同：结构十分相似，二者相比有几点不同：（1）核糖核糖;（2）碱基：碱基：a、 g、 c、 u（3）二者在三维结构上的区别二者在三维结构上的区别rna不具有规不具有规则的氢键结构，单链形式存在，只是回折，局部则的氢键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。配对，不配对形成突环。n2、 trna p197n由70-90个核苷酸组成，但修饰成分多。在蛋白质合成过程中具有转运氨基酸、识别密码子的作用，在dna反转录合成及基因表达调控中起着重要的作用

15、。trna有有“接头接头” (adaptor)功能，具功能，具备双重特性备双重特性:识别氨基酸识别氨基酸其其 3末端的腺苷酸末端的腺苷酸可与一氨基酸共价可与一氨基酸共价连接连接识别密码子识别密码子反反密码子与密码子与mrna中中的密码子碱基配对。的密码子碱基配对。（1）、结构特点：）、结构特点： a、有较多的稀有碱基，多为转有较多的稀有碱基，多为转录后加工而来。录后加工而来。 b、3末端为氨基酸接受臂末端为氨基酸接受臂cca。 c、5末端作为末端作为g or c。n2、二级结构、二级结构三叶草形：三叶草形：n叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。na、接受臂：

16、、接受臂：接受活化接受活化aa，末端为，末端为cca。nb、tc环：环：假鸟嘧啶，有假鸟嘧啶，有tc顺序。顺序。nc、额外环、额外环(可变环）：可变环）：变化最大区域，不变化最大区域，不同同trna不同大小额外环。不同大小额外环。nd、反密码环：、反密码环：7个核苷酸组成，环中部反个核苷酸组成，环中部反密码子。三对碱基组成。密码子。三对碱基组成。ne、二氢尿嘧啶环：、二氢尿嘧啶环：8-12核苷酸，两个二核苷酸，两个二氢尿嘧啶。氢尿嘧啶。 接受臂：3端有一游离的cca顺序，氨基酸通过共价键与a上的2-oh或3-oh相连；tc臂：是假尿嘧啶。该臂上有tc的顺序。 反密码子臂：在反密码子环的中间是三

17、联的反密码子。二氢尿嘧啶臂（d臂）：环中含有二氢尿嘧啶。 额外臂：变化最大的区域，可分为两类，一类仅含3-5个核苷酸，另一类含有一条较大的臂。ala的trna结构示意图a space-filling model shows that yeast trnaphe tertiary structure is compact. the two views of trna are rotated by 90.n（3）三级结构：）三级结构：倒倒l型：靠氢键型：靠氢键维持。维持。靠氢键维持，靠氢键维持，trna 三级三级结构呈结构呈l形；形；受体臂顶端的碱基位于受体臂顶端的碱基位于“l”的一个端点，而反密

18、码子臂的一个端点，而反密码子臂的套索状结构生成了的套索状结构生成了“l”的另一端点，分子中两个不的另一端点，分子中两个不同的功能基团是最大限度分同的功能基团是最大限度分离的。这个结构形式与离的。这个结构形式与aa-trna合成酶对合成酶对trna的识别的识别有关，满足了蛋白质合成过有关，满足了蛋白质合成过程中对程中对trna的各种要求。的各种要求。trna l形三级结构形三级结构反密码子环3氨基酸臂n3、rrna p199nrrna占rna总量的80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rrna和数十种蛋白质组成。nrrna与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂

19、。核糖体上催化肽键合成的是rrna，蛋白质只是维持rrna的构象，起辅助作用。rrna的二级结构图示的二级结构图示n4、mrna p201n（1）原核生物）原核生物mrna结构特征结构特征 p201n原核生物的原核生物的mrna链上有多个编码区链上有多个编码区（多个基因），为多顺反子，（多个基因），为多顺反子，5和和3端各端各有一段非翻译区。有一段非翻译区。n多顺反子：一个转录本加工 而 成 的多顺反子：一个转录本加工 而 成 的mrna序列中包含多个基团。序列中包含多个基团。n编码区：编码区：mrna中以中以aug为起点，以终为起点，以终止密码子为终点，编码止密码子为终点，编码aa的一系列密

20、码的一系列密码子序列。子序列。n前导区：前导区：mrna5端编码区前面的非翻译端编码区前面的非翻译序列。序列。n尾区：尾区：mrna3端终止密码子后非翻译序端终止密码子后非翻译序列。列。原核生物原核生物mrna结构结构n（2）真核生物）真核生物mrna结构特征结构特征 p201n真核生物的真核生物的mrna都是单顺反子。都是单顺反子。n单顺反子：一个转录本加工 而 成 的单顺反子：一个转录本加工 而 成 的mrna序列只代表一个基因。序列只代表一个基因。nmrna 5端都有帽子结构。端都有帽子结构。n绝大多数真核生物绝大多数真核生物mrna具有具有poly(a)尾尾。真核生物真核生物mrna的

21、结构模式的结构模式eukaryotic mrna is modified by addition of a cap to the 5 end and poly(a) to the 3 end真核生物转录常从真核生物转录常从嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸开始，第开始，第1个核苷酸保个核苷酸保留留5三磷酸基团，以三磷酸基团，以3位与下一核苷酸位与下一核苷酸5位形成磷酸位形成磷酸二酯键。转录的起始序列可表示为二酯键。转录的起始序列可表示为5pppapnpnpnp；在鸟苷酰转移酶催化下在其在鸟苷酰转移酶催化下在其5加入加入g，且连接形式是，且连接形式是5 5三磷酸键。表示为：三磷酸键。表示为：5gpppapnp

22、np+pp+p。“帽帽子子”结结构构帽子帽子0 0：第第1 1个甲基个甲基在末端鸟嘌呤在末端鸟嘌呤7 7位上，位上，所有真核生物均存所有真核生物均存在此结构。在此结构。帽子帽子1 1：第第2 2个甲基个甲基加到次末端核苷酸加到次末端核苷酸上，具有两个甲基。上，具有两个甲基。在高等真核生物中，在高等真核生物中，如果转录的第如果转录的第1 1个核个核苷酸是苷酸是a a的话，则在的话，则在a a的的n n6 6位上还有一个位上还有一个甲基。甲基。帽子帽子2 2：以帽子以帽子1 1为为底物，在第三个核底物，在第三个核苷酸再加上一个甲苷酸再加上一个甲基。基。“帽子”结构的甲基化n 帽子结构功能：帽子结构

23、功能：na、增加增加mrna稳定性，保护稳定性，保护mrna免遭免遭5外切酶的攻击。外切酶的攻击。nb、有助于核糖体对有助于核糖体对mrna的识别和的识别和结合，使翻译得以正确起始。结合，使翻译得以正确起始。nmrna poly(a)尾功能：尾功能：a、防止防止mrna降解，大大提高了降解，大大提高了mrna在细胞质中的稳定性。在细胞质中的稳定性。b、是是mrna穿越核膜由细胞核进入细胞穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。质的必需形式。c、与翻译有关；切除与翻译有关；切除poly(a)尾会影响翻尾会影响翻译起始。译起始。第四节 核酸的性质 p205n一、一般性质一、一般性质n1、外观：、外观

24、：dna白色纤维状，白色纤维状，rna白色粉末；白色粉末；n2、溶解性：、溶解性：极性化合物，微溶于水但不溶于乙醇、极性化合物，微溶于水但不溶于乙醇、乙醚、氯仿、三氯醋酸等有机溶剂，常以乙醇进行乙醚、氯仿、三氯醋酸等有机溶剂，常以乙醇进行沉淀，其钠盐易溶于水，溶解度与沉淀，其钠盐易溶于水，溶解度与ph有关；有关；n3、黏度：、黏度：dna溶液的黏度极高，溶液的黏度极高，rna溶液的黏度小溶液的黏度小n4 4、颜色反应：、颜色反应：rnarna与浓与浓hclhcl和苔黑酚（甲基间苯二酚）和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色，原因：共热产生绿色，原因：d-d-核糖与酸作用产生糠醛，核糖与酸作用产生

25、糠醛，糠醛与甲基间苯二酚作用呈绿色；糠醛与甲基间苯二酚作用呈绿色；dnadna与强酸和二苯与强酸和二苯胺一同加热呈蓝色，原因：胺一同加热呈蓝色，原因：d-2-d-2-脱氧核糖与酸作用脱氧核糖与酸作用产生产生-羟基羟基-酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色。酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色。二、核酸的水解：n1 1、酸水解：、酸水解：n磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。n磷酸酯键比糖苷键稳定；磷酸酯键比糖苷键稳定；n嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定；嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定；n嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定 。n2 2、碱水解、

26、碱水解nrnarna的磷酸酯键易被碱水解；的磷酸酯键易被碱水解；dnadna的磷酸酯键对碱稳定。的磷酸酯键对碱稳定。原因：原因：na a、rnarna核糖上核糖上2-oh2-oh基，在碱性条件下形成磷酸三酯，基，在碱性条件下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生22，33环磷酸酯，环磷酸酯，进而分解成进而分解成22或或33核苷酸，溶液成为混合液。核苷酸，溶液成为混合液。nb b、dnadna核糖上无核糖上无2-oh2-oh基，不能形成磷酸三酯中间物，基，不能形成磷酸三酯中间物，因此可以抵抗碱水解。因此可以抵抗碱水解。rna水解后生成一个水解后生成一个2,

27、3环式单核苷酸中间体；环式单核苷酸中间体；中间体不稳定，很快转变为中间体不稳定，很快转变为2单核苷酸和单核苷酸和3单核苷酸单核苷酸3、酶水解：n核糖核酸酶核糖核酸酶na、牛胰核糖核酸酶：、牛胰核糖核酸酶：n专一性切割位点：嘧啶核苷专一性切割位点：嘧啶核苷-3-磷酸与其磷酸与其它核苷酸之间的连键。它核苷酸之间的连键。n产物：产物：3-嘧啶核苷酸；或以嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。酸结尾的寡核苷酸。n水解机制：同碱相似。水解机制：同碱相似。nb、核糖核酸酶、核糖核酸酶t1n 专一性切割位点：专一性切割位点：3-鸟苷酸与其相邻的鸟苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连键。核苷酸之间

28、的连键。n 产物：产物： 3-鸟苷酸；或以鸟苷酸；或以3 -鸟苷酸结尾鸟苷酸结尾的寡核苷酸。的寡核苷酸。nc、核糖核酸酶、核糖核酸酶t2n专一性切割位点：专一性切割位点：3-腺苷酸与其相邻的腺苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连键。核苷酸之间的连键。n 产物：产物： 3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。腺苷酸结尾的寡核苷酸。n脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶na、牛胰脱氧核糖核酸酶：、牛胰脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链切断双链或单链dna成为成为5-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度度4个核苷酸。个核苷酸。nb、牛脾脱氧核糖核酸酶：、牛脾脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链切断双链或单链dna

29、成为成为3-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度度6个核苷酸。个核苷酸。nc、链球菌脱氧核糖核酸酶：、链球菌脱氧核糖核酸酶：产物为产物为5-磷酸为磷酸为末端的寡核苷酸，长短不一。末端的寡核苷酸，长短不一。nd、限制性内切酶：、限制性内切酶：在细菌中发现这类酶，主在细菌中发现这类酶，主要降解外源要降解外源dna，对自身，对自身dna无作用。无作用。n限制性内切酶特点：限制性内切酶特点：切割位点往往是回切割位点往往是回文结构；具有高度专一性，识别双链特文结构；具有高度专一性，识别双链特定的位点，将两条链切开成粘性、平头定的位点，将两条链切开成粘性、平头末端；用于染色体结构分析

30、、基因测序末端；用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。的分析、基因的体外重组。三、核酸的酸碱解离性质 (参见p182)n1、碱基的解离、碱基的解离n嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合和释放质子的能力，因此是和释放质子的能力，因此是兼性离子兼性离子，即是两性，即是两性电解质。电解质。n胞嘧啶的解离；胸腺嘧啶的解离；胞嘧啶的解离；胸腺嘧啶的解离；n腺嘌呤的解离；鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离；腺嘌呤的解离；鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离；n2、核苷的解离：、核苷的解离：糖的存在增加了酸性解离糖的存在增加了酸性解离n3、核苷酸的解离：、核苷酸的解离：n

31、磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。n四、核酸的紫外吸收：四、核酸的紫外吸收： 参见参见p182n核酸中碱基环的共轭双键对核酸中碱基环的共轭双键对240290nm波波段紫外光有强烈吸收。最大光吸收值在段紫外光有强烈吸收。最大光吸收值在260nm，是核酸定量以及定性的基础。由，是核酸定量以及定性的基础。由于蛋白质在此光区仅有弱吸收，故可以此于蛋白质在此光区仅有弱吸收，故可以此特性来测定核酸在细胞和组织中的分布。特性来测定核酸在细胞和组织中的分布。n用用a260/a280的比值可以判断样品的纯度：的比值可以判断样品的纯度：n纯纯dna的的a260/a280比

32、值应为比值应为1.8,n纯纯rna应为应为2.0；n摩尔吸光系数摩尔吸光系数(p)值；值；(p)=a/cl。n（一）变性：（一）变性： （p208）n1、概念：、概念：许多因素可以破坏氢键，氢键破许多因素可以破坏氢键，氢键破坏后的核酸的双螺旋结构变成单链的，成坏后的核酸的双螺旋结构变成单链的，成为为“无规线团无规线团”，此作用称为核酸的变性。，此作用称为核酸的变性。变性是双螺旋氢键的断裂，不涉及共价键变性是双螺旋氢键的断裂，不涉及共价键（磷酸二酯键）断裂。（如果磷酸二酯键（磷酸二酯键）断裂。（如果磷酸二酯键断裂则叫降解，此时分子量降低）断裂则叫降解，此时分子量降低）n2、引起变性的因素：、引起

33、变性的因素：n1）温度的升高；温度的升高；n2）碱酸度改变；碱酸度改变；n3）某些变性剂：尿素、甲醛等。某些变性剂：尿素、甲醛等。五、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的变性、复性及杂交 p2083、变性的特点：n1）结构变成无规则线团；结构变成无规则线团；n2）260nm紫外吸光度急剧升高；粘度下紫外吸光度急剧升高；粘度下降；生物活性丧失降；生物活性丧失n3）爆发式，变性发生在很窄的温度范围，爆发式，变性发生在很窄的温度范围，有一个相变的过程。有一个相变的过程。n熔解温度（熔解温度（tm值）：双螺旋失去一半时值）：双螺旋失去一半时的温度。的温度。 也叫熔点、解链温度。也叫熔点、解链温度。4、影响

34、dna的tm的因素：n（1）dna均一性：均一性：n均质均质dna熔解过程在一个较窄的温度范围内；熔解过程在一个较窄的温度范围内；异质异质dna熔解过程在一个较宽的温度范围内。熔解过程在一个较宽的温度范围内。n（2）g-c含量：含量：ng-c含量越高含量越高tm值愈高；值愈高；n原因：原因：gc atn测定测定tm可以推算出可以推算出dna碱基的百分组成。碱基的百分组成。n经验公式：经验公式：xg-c=（ tm-69.3)x2.44； （3）介质离子强度）介质离子强度n离子强度较低的介质中离子强度较低的介质中,tm值较低值较低, 熔解熔解温度范围较宽；温度范围较宽；n离子强度较高的介质中离子强

35、度较高的介质中,tm值较高值较高,熔解熔解温度范围较窄。温度范围较窄。nrna的变性：的变性：n螺旋区较少螺旋区较少,变性变性tm值较低；值较低；trna螺旋螺旋区较多区较多,变性变性tm值较高，类似于值较高，类似于dna。（二）复性（二）复性 （p209）n变性后变性后dna两条分开的链重新特异的组两条分开的链重新特异的组合而恢复双螺旋结构和性质，这种作用合而恢复双螺旋结构和性质，这种作用称复性。复性可部分恢复理化性质，变称复性。复性可部分恢复理化性质，变性性dna骤然降温不能复性，据此可制备骤然降温不能复性，据此可制备单链核酸探针。单链核酸探针。n缓慢冷却复性称缓慢冷却复性称退火退火。片段

36、越大复性越。片段越大复性越慢；浓度越大复性越快。慢；浓度越大复性越快。n单核苷酸单核苷酸(p) 值大于单链多核苷酸；值大于单链多核苷酸；n单链核苷酸单链核苷酸(p)值大于双链核苷酸，值大于双链核苷酸，n因此核酸变性时因此核酸变性时, (p)值增高，称增色效值增高，称增色效应；核酸复性时应；核酸复性时, (p)值降低，称减色效值降低，称减色效应。应。n常用核酸溶液紫外吸收值的变化作为变常用核酸溶液紫外吸收值的变化作为变性或复性的指标。性或复性的指标。 双螺旋呼吸：双螺旋呼吸： 双链双链dnadna配对碱基的氢键不断处于断裂和再配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含生状态

37、中，特别是在稳定性较低的富含a-ta-t的区段。在微观上，常常出现瞬间的单链的区段。在微观上，常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作呼吸作用用。一些蛋白质可识别这种结构，并在单。一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和识别链结构下阅读和识别dnadna内部所含信息。内部所含信息。（三）杂交（三）杂交 （p210）ndna的变性在一定条件下是可逆的，的变性在一定条件下是可逆的，而相同来源的而相同来源的dna分子容易通过这种分子容易通过这种方式进行杂交，甚至不同来源的方式进行杂交，甚至不同来源的dna以及多核糖核苷酸与多脱氧核糖核苷以及多核糖核苷

38、酸与多脱氧核糖核苷酸之间也可以进行杂交。酸之间也可以进行杂交。n1、概念：、概念：不同来源的分子，经热变不同来源的分子，经热变性后冷却复性，如异源间某些区域有性后冷却复性，如异源间某些区域有相同的序列，则会形成杂交分子。相同的序列，则会形成杂交分子。核酸杂交核酸杂交filter hybridization establishes whether a solution of denatured dna (or rna) contains sequences complementary to the strands immobilized on the filter.n 样品酶解琼脂糖电泳分离变性

39、、转移硝酸纤维薄膜只吸收单链与放射性探针杂交十小时，洗涤烘干放射自显影，可探知或分离互补系列dna2、southern（edwen southern）杂交： （印记技术、固相杂交）（p428）样品酶解琼脂糖电泳分析变性转移硝酸纤维薄膜只吸收单链与放射性探针杂交十小时洗涤烘干放射自显影3、dna聚合酶链反应（pcr）（p423）原理：1）变性：通过加热使双链dna变成单链dna。2）退火：温度突然降低，引物与模板链局部形成杂交链。3）延伸：在dna聚合酶的作用下，进行dna链延伸反应。以上三步为一个循环。基本步骤：a、设计一对引物：应尽量减少非特异产物。b、优化反应体系：适量模板，引物，4种dn

40、tp,taqdna聚合酶,mg2+。c、选择热循环温度：变性温度，退火温度，延伸温度。d、鉴定扩增产物：一般用凝胶电泳。5. 核酸的分离和纯化n一、分离的一般原则一、分离的一般原则n要保持天然性，因此要求在提取过程中要保持天然性，因此要求在提取过程中掌握下列原则：掌握下列原则：n1、防止核酸酶的降解；、防止核酸酶的降解；n2、防止化学因素的降解；、防止化学因素的降解；n3、防止物理因素的降解。、防止物理因素的降解。二、dna的分离纯化n预处理：将细胞提取物用1 mol/l nacl溶解，然后稀释至0.14 mol/l，离心，沉淀为dnp，（溶液中含rnp）。dnp的蛋白质部分可用下列方法除去：

41、n1、苯酚法n2、辛醇氯仿法n3、sds法n将不同构象的dna进行分离： n蔗糖密度梯度超离心大小不等的线性 dna 分开，也可将分子量相同而构象不同的dna分开；n氯化铯密度梯度平衡超离心双股dna和单股dna分开；n氯化铯-溴化乙锭梯度离心双链dna的环状dna和线状dna分开。n羟基磷灰石（ha）或白蛋白硅藻土（mak）柱层析分离变性dna和天然dna。三、rna的分离纯化n预处理：细胞均浆进行差速离心，制得细胞核、叶绿体、线粒体、核糖体等细胞器和细胞溶质，然后再从这些细胞器中分离某一类rna。rnp除蛋白的方法与dnp除蛋白的方法相似。nrna的提取多采用酚提取法n进一步纯化多种方式：密度梯度离心、deae纤维素、deaesephadex、甲基化白蛋白硅藻土等各