荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV

1、荧光定量荧光定量pcr的原理及临床应用的原理及临床应用苏晓霁苏晓霁如何做一个如何做一个“聪明聪明”的实习生的实习生l实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。l如何做到：如何做到： 实习之前要复习理论知识和实验课内容实习之前要复习理论知识和实验课内容 “理论先行理论先行” 实习过程中要实习过程中要“聪明聪明” 做好实习笔记，用心思考，做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫实习之外下功夫如何做一个如何做一个“聪明聪明”的实习生的实习生聪聪明明耳：认真听老师的说明和讲解

2、耳：认真听老师的说明和讲解看：仔细看老师的操作看：仔细看老师的操作问：有疑问要多提问，多讨论问：有疑问要多提问，多讨论心：要用心去思考心：要用心去思考日月：要每天每月坚持做到日月：要每天每月坚持做到内容概要内容概要lpcr的定义和原理的定义和原理l荧光定量荧光定量pcr的原理和分类的原理和分类l荧光定量荧光定量pcr结果的分析结果的分析l荧光定量荧光定量pcr在临床的应用在临床的应用pcr的定义的定义lpcr是是polymerase chain reaction的缩写，中的缩写，中文称为文称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，由，由变性变性、退火退火及及延延伸伸几步反应组成一个周期几步反应组成一个

3、周期,循环进行循环进行,可使目可使目的的dna得以迅速扩增。得以迅速扩增。l由美国由美国pe公司遗传部的公司遗传部的dr. mullis发明，由于发明，由于pcr技术的跨时代意义，技术的跨时代意义，mullis获得了获得了1993年年诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。 pcr的原理的原理l变性变性：双链：双链dna在高温下解开成单链的过程在高温下解开成单链的过程 。温。温度一般为度一般为95左右。左右。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact55ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggact

4、cgacact5加热加热pcr的原理的原理l退火退火：温度下降后，两条配对的单链：温度下降后，两条配对的单链dna重新重新结合为双链的过程。温度一般为结合为双链的过程。温度一般为5060。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctcggactcgacact5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctcggactcgacact降温降温pcr的原理的原理l延伸延伸：dna聚合酶催化以引物为起始点的聚合酶催化以引物为起始点的dn

5、a链延伸反应链延伸反应 。温度一般为。温度一般为72左右。左右。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctcggactcgacact5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctc cctgagctgtgaggtgacggagag ggactcgacact恒温恒温普通普通pcr的原理的原理普通普通pcr的原理的原理lpcr反应成分：反应成分： 1.模板模板dna 2.引物引物 3.四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸 4.d

6、na聚合酶聚合酶(taq酶酶) 5.反应缓冲液、反应缓冲液、mg2+等等 6.荧光探针（荧光定量荧光探针（荧光定量pcr）taq酶的发现酶的发现l在在taq酶发现之前，实验室的酶发现之前，实验室的pcr反应中运用反应中运用的是大肠杆菌的是大肠杆菌dna聚合酶聚合酶的的klenow片段。片段。lklenow酶不耐高温，酶不耐高温，90加热后会加热后会变性失活变性失活，每次循环结束都要加入新鲜的酶。每次循环结束都要加入新鲜的酶。l而且而且dna的延伸是在的延伸是在37完成，模板和引物容完成，模板和引物容易错配，造成反应的易错配，造成反应的特异性很差特异性很差。taq酶的发现酶的发现l美国的嗜热菌研

7、究室在黄石国家公园温泉中发美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌现了嗜热菌(thermus aquaticus)株，株，cetus公司公司研究人员从中分离了研究人员从中分离了taq dna聚合酶聚合酶l特点：特点：耐高温：耐高温：70 2h 活性活性90%，93 2h 活性活性60%，95 2h 活性活性40% ； 延伸温度延伸温度较高较高(一般为一般为72 )：大大：大大提高了扩增特异性、提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率灵敏性和扩增效率。荧光定量荧光定量pcrl概念：在概念：在pcr反应中加入反应中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积或变化实时监测信号累积或变化实时

8、监测整个反应过程，最后整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。方法。l实时荧光定量实时荧光定量pcr技术于技术于1996年由美国年由美国applied biosystems，abi公司公司推出，实现了推出，实现了pcr从定性从定性到定量的飞跃。到定量的飞跃。实时荧光定量实时荧光定量pcr的原理的原理l利用利用荧光信号的变化荧光信号的变化实时监测实时监测pcr反反应的每个循环的扩增产物量的变化。应的每个循环的扩增产物量的变化。l通过通过ct值值和和标准曲线分析标准曲线分析对起始标本对起始标本的模板量进行定量分析。的模板量进行定量分析

9、。与普通与普通pcr的比较的比较l普通普通pcr完成后，一般只对扩增的最终完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为产物量进行分析，分析结果多为定性定性或者半定量或者半定量结果。结果。l荧光定量荧光定量pcr通过监测荧光值的变化，通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为分析结果为定量定量结果。结果。与普通与普通pcr的比较的比较l普通普通pcr完成后，才能进行扩增产物的完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染生物危害和环境污染。l荧光定量荧光定量pcr

10、的扩增和产物分析过程是的扩增和产物分析过程是同时完成同时完成的，而且在的，而且在封闭封闭的反应体系中的反应体系中进行，比较安全，易于处理。进行，比较安全，易于处理。常用的名词概念常用的名词概念l本底信号（本底信号（baseline）l荧光阈值（荧光阈值（threshold）lct值（值（ct value）l扩增曲线扩增曲线前前15个循环荧光信号的均值，可个循环荧光信号的均值，可手动调节选择手动调节选择默认是第默认是第315个循环的荧光信号的标个循环的荧光信号的标准偏差的准偏差的10倍，也可手动调节倍，也可手动调节扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时

11、所经过的扩增循环数时所经过的扩增循环数常用的名词概念常用的名词概念thresholdbaselinect value荧光强度荧光强度rn扩增循环数扩增循环数对数增长期对数增长期实际中的运用实际中的运用左图为左图为5个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，右图以右图以ct值为纵坐标，值为纵坐标，lgxs为横坐标，可计算得出标准曲线为横坐标，可计算得出标准曲线实时荧光定量实时荧光定量pcr的分类的分类l目前的实时荧光定量目前的实时荧光定量pcr均是基于均是基于荧光共振能荧光共振能量转移量转移（fluorescence resonance energy trans

12、fer，fret）的原理。）的原理。fq10nmffluorophore,荧光基团荧光基团qquencher，淬灭基团淬灭基团fq10nm荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（fret）发生的条件）发生的条件l荧光基团和淬灭基团都能发射荧光荧光基团和淬灭基团都能发射荧光l荧光基团的荧光基团的发射光谱发射光谱和淬灭基团的和淬灭基团的激发光谱激发光谱需需有效重叠有效重叠l荧光基团和淬灭基团应足够的近（荧光基团和淬灭基团应足够的近（500bp片段敏感片段敏感 75%或无水乙醇溶液喷雾或无水乙醇溶液喷雾荧光定量荧光定量pcr在临床的应用在临床的应用l在反应体系中使用在反应体系中使用dutp和和ung酶消

13、除以酶消除以往实验的污染影响往实验的污染影响 ung酶（尿嘧啶酶（尿嘧啶-n-糖基化酶）：选择性糖基化酶）：选择性水解断裂含有水解断裂含有du的双链和单链中的尿嘧的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最佳活性温度是步水解断裂，酶的最佳活性温度是50，在在95 失活。失活。荧光定量荧光定量pcr在临床的应用在临床的应用气溶气溶胶污胶污染物染物50 2min， 95 灭活加入加入ung酶酶荧光定量荧光定量pcr在临床的应用在临床的应用5ccactgcctctc cctgagctgtga35ccacugccucuc ccugagcug

14、uga3扩增扩增加入加入dutp5ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga3ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga3潜在气溶胶污染物潜在气溶胶污染物502min加入加入ung酶酶5断裂的核苷酸片段断裂

15、的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3荧光定量荧光定量pcr在临床的应用在临床的应用l乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒dna(hbv-dna)leb病毒病毒dna(ebv-dna)l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna(hcmv-dna)l肺炎支原体肺炎支原体dna(mp-dna)l肺炎衣原体肺炎衣原体dna(c

16、p-dna)临床标本的采集临床标本的采集检检 测测 项项 目目标标 本本 类类 型型 及及 要要 求求hbv-dna血清或者血浆血清或者血浆 100l(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)ebv-dna血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)hcmv-dna血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml (不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)mp-dna cp-dna咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液 1ml人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l用于器官移植、骨髓移植及用于器官移植、骨髓移植及hiv阳性阳性/aids患者人巨细胞病毒感染

17、的患者人巨细胞病毒感染的辅助诊断辅助诊断和疗效监控和疗效监控。l临床上可以采用的标本类型：临床上可以采用的标本类型：尿液尿液、乳乳汁汁、血清、血浆或血清、血浆或淋巴细胞淋巴细胞样本中人巨样本中人巨细胞病毒细胞病毒dna。人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆）100l血清血清或血浆或血浆100l dna浓浓缩液缩液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆）加入加入50ldna提

18、提取液取液剧烈振荡剧烈振荡混匀混匀5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆）4放放置或用置或用于于pcr振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）1ml尿液尿液或乳汁或乳汁去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）加入加入

19、50ldna提提取液取液剧烈振荡剧烈振荡混匀混匀5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒dna的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）4放放置或用置或用于于pcr振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 1ml抗抗凝全血凝全血1ml生生理盐水理盐水0.3ml淋巴淋巴细胞分离液细胞分离液人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna的提取（淋巴细胞的提取）的

20、提取（淋巴细胞的提取）水平离心机水平离心机2500rpm，15min淋巴细胞层淋巴细胞层吸取淋巴吸取淋巴细胞悬液细胞悬液人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取）淋巴细胞淋巴细胞悬液悬液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min人巨细胞人巨细胞病毒病毒dna定量检测试剂盒定量检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取）加入加入50ldna提提取液取液剧烈振荡剧烈振荡混匀混匀5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna检

21、测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒dna的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取）4放放置或用置或用于于pcr振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min荧光定量荧光定量pcr扩增过程扩增过程50942min5min9315s5730sstage1stage2stage345 1 1251minstage4 1dna浓缩液的作用浓缩液的作用ldna浓缩液的成分：浓缩液的成分：peg6000、nacllpeg（聚乙二醇）的作用：（聚乙二醇）的作用：peg与自由水分子与自由水分子结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水分子结合的极性集团

22、转而与多聚物的氧原子或分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，从溶液中沉淀析出。从溶液中沉淀析出。提高低浓度标本的检出率提高低浓度标本的检出率。lpeg的浓度与沉淀出的的浓度与沉淀出的dna片段大小成反比。片段大小成反比。 dna浓缩液的作用浓缩液的作用lnacl的作用：在细胞内的作用：在细胞内dna与蛋白质结合成与蛋白质结合成脱脱氧核糖核蛋白氧核糖核蛋白dnp ，而，而rna与蛋白质结合成为与蛋白质结合成为核糖核蛋白核糖核蛋白rnp,在不同盐浓度中二者溶解度不在不同盐浓度中二者溶解度不一样。一样。ldnp在纯

23、水或者在纯水或者12m的的nacl溶解度较大，在溶解度较大，在0.14m溶解度较低，而溶解度较低，而0.14m中中rnp溶解度较大，溶解度较大，因此因此利用利用0.14m可分离可分离rnp和和dnp。 dna提取液的作用提取液的作用ldna提取液的主要成分：提取液的主要成分： np-40 tritonx-100 chelex-100 edta(ph8.0) tris-hcl (ph 8.0) naoh （乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱 （聚乙二醇辛基苯基醚（聚乙二醇辛基苯基醚 ）一种非离子性去垢剂，）一种非离子性去垢剂，被用来做细胞破膜剂被用来做细胞破膜剂/细胞通透剂细胞通透剂 （聚苯乙烯二乙烯基苯）提取（聚苯乙烯二乙烯基苯）提