04药物定量分析与分析方法验证

1、药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证 一、掌握定量分析方法验证的效能指标。一、掌握定量分析方法验证的效能指标。 二、熟悉定量分析样品的前处理方法。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。 三、了解定量分析样品的前处理方法的进展三、了解定量分析样品的前处理方法的进展 及在药物分中的应用。及在药物分中的应用。基本要求基本要求第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法第二节第二节 定量分析方法特点定量分析方法特点第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求主要内容主要内容 1. 1.为什

2、么要对定量分析的样品进行前处理？为什么要对定量分析的样品进行前处理？ 含卤素有机药物含卤素有机药物 r-x （f，cl, br, i ） 金属有机药物金属有机药物 r-o-me（有机酸或酚的有机酸或酚的 含金属有机药物含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）金属盐；结合不牢固） 有机金属药物有机金属药物 r-me （结合牢固）结合牢固） 2. 常用的处理方法常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 药物分析中常用的分析方法药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法概述概述（一）直接测定法（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采

3、用铈量法溶于热稀矿酸，采用铈量法 ，邻二氮，邻二氮菲作指示剂菲作指示剂 chchccoo0fe不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法（二）经水解后测定法（二）经水解后测定法 1. 直接回流后测定法直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定例如：三氯叔丁醇的含量测定 ccl3-c(ch3)2-oh + 4naoh (ch3)2co +3nacl + hcoona +2h2o nacl + agno3 agcl + nano3 agno3 + nh4scn agscn + nh4no3 2. 用硫酸水解后测定法用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定例如：硬脂酸镁的含量测定 mg(c1

4、7h35coo)2 + h2so4 mgso4 + 2c17h35cooh h2so4 + 2naoh na2so4 + 2h2o （三（三）经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法 1. 碱性还原后碱性还原后测定测定 例如：泛影酸的含量测定例如：泛影酸的含量测定 2. 酸性还原后酸性还原后测定测定 例如：碘番酸的含量测定例如：碘番酸的含量测定 zn还原还原 后银量法后银量法 coohiiinhcoch3ch3conhcoohh2nnh2+ 11naoh + 3zn+ 3nai + 2ch3coona + 3nazno2 + 3h2o nai + agno3 agi + nano3 3. 利用药物

5、中可游离的金属离子的氧化性测定含量利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 （1）含锑药物）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定例如：葡萄糖酸锑的含量测定 sb5+ + 2ki sb3+ + 2k+ + i2 i2 + 2na2s2o3 2nai + na2s4o6 （2）含铁药物含铁药物 2fe3+ + 2ki 2fe2+ + 2k+ + i2 i2 + 2na2s2o3 2nai + na2s4o6h+经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法1. 适合对象：适合对象：含金属、含金属、x、n、s、p等有机药物，与等有机药物，与c原子结合牢固原子结合牢固2. 分类：分类： 湿法破坏：湿法破坏

6、：主要用于含主要用于含n有机药物；主要以硫酸作有机药物；主要以硫酸作为分解剂，并结合氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧为分解剂，并结合氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢、高锰酸钾等）化氢、高锰酸钾等） 干法破坏：干法破坏：凯氏定氮法原理1.nh2硝化生成硝化生成nh4：2.与碱作用，通过蒸馏释放出与碱作用，通过蒸馏释放出nh3 ，收集于，收集于h3bo3 溶液中溶液中 3.用已知浓度的用已知浓度的h2so4（或（或hcl）标准溶液滴定，根据酸消）标准溶液滴定，根据酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量得蛋白质的含量+244 h s

7、o +2h2424cuso2nh -(nh ) so 浓424322433342472(nh ) so +2naoh2nh+2h o+na so2nh +4h bo(nh ) b o +5h o+42472433(nh ) b o +2h +5h o2nh+4h bo消解剂消解剂1.作用：作用：缩短消解时间，避免铵盐分解。缩短消解时间，避免铵盐分解。2.硫酸钾：硫酸钾：提高硫酸沸点，以提高消解温度；提高硫酸沸点，以提高消解温度；3.催化剂：催化剂：汞盐、硒盐、铜盐等，其中以硫酸铜汞盐、硒盐、铜盐等，其中以硫酸铜最常用。最常用。4.对于含氮杂环结构，消解中需要加入辅助氧化对于含氮杂环结构，消解中

8、需要加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短消解时间，常用为剂，使分解完全并缩短消解时间，常用为30%过氧化氢和高氯酸。过氧化氢和高氯酸。仪器装置与操作仪器装置与操作药物药物硫酸钾硫酸钾硫酸铜硫酸铜硫酸硫酸药物药物硫酸钾硫酸钾硫酸铜硫酸铜硫酸硫酸2%硼酸硼酸甲基红甲基红-溴甲酚氯溴甲酚氯40%naoh锌粒锌粒半微量法http:/ 原理：原理：将待测元素有机药物在密闭的燃烧瓶中充分燃烧，将待测元素有机药物在密闭的燃烧瓶中充分燃烧，彻底分解成彻底分解成co2和水，而待测元素转化成不同价态的氧和水，而待测元素转化成不同价态的氧化物（或无氧酸），被适当吸收液吸收后采用适宜方法化物（或无氧酸），被适当吸收液吸收

9、后采用适宜方法分析。分析。2. 仪器装置：仪器装置：500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质玻璃锥磨口、硬质玻璃锥形瓶形瓶3. 吸收液的选择：吸收液的选择：用于用于x、s、se等的鉴别、检查、含量测等的鉴别、检查、含量测定时多数是定时多数是h2o或或h2o-naoh；少数为少数为h2o-naoh-h2o2氧燃瓶燃烧法氧燃瓶燃烧法吸收液的选择吸收液的选择药物类型药物类型燃烧产物燃烧产物吸收液吸收液检查方法检查方法fhfh2o茜素氟蓝比色茜素氟蓝比色clhclh2o-naoh银量法银量法brbr2、hbrh2o-naoh（h2so3）银量法银量法ih2o-naoh（h2so3）碘量

10、法碘量法sso3h2o浓浓h2o2沉淀法沉淀法pp2o5h2o少量硝酸少量硝酸钼蓝比色法钼蓝比色法应用示例：碘苯酯的测定应用示例：碘苯酯的测定ichch3(ch2)8-cooc2h5i2o2(i )_i2 + 2naoh naio + nai + h2o 3naio naio3 + 2nai 3br2 + i +3h2o io3 + 6hbrbr2(guo) + hcooh hbr + co2 io3 + 5i + 6h 3i2 + 3h2oi2 + 2na2s2o3 2nai + na2s4o6ch3cooh-+-返 回定量分析方法特点定量分析方法特点 一、容量分析法一、容量分析法 （一）容

11、量分析法的（一）容量分析法的特点特点 操作简单、快速；操作简单、快速； 比较准确（比较准确（rsdrsd0.2%0.2%）； 仪器普通易得。仪器普通易得。（二）容量分析法的（二）容量分析法的计算计算问题问题 1. 1. 滴定度滴定度（t t）的概念的概念 每每1 1mlml规定浓度的滴定液相当于被测物规定浓度的滴定液相当于被测物质的量质的量( (mg)mg) 2. 2. 滴定度的计算滴定度的计算 aaaa + + bbbb cccc + + dddd t t = = m mb/ab/ab b 3. 3. 百分含量的计算百分含量的计算 （1 1）直接滴定法）直接滴定法 d% = d% = v v

12、 f f t/wt/w 100%100% f f = = 实际标定的浓度实际标定的浓度/ /规定的浓度规定的浓度 （2 2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法） d% = d% = （v vo o v vb b) ) f f t t/ /w w 100%100% 二、光谱分析法二、光谱分析法 （一）紫外（一）紫外- -可见分光光度法（可见分光光度法（200200nmnm760nm)760nm) 灵敏度高，可达灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点特点 准确度高，准确度高，srd（%）为为2% 5%5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用仪

13、器价格低廉，操作简单，易普及，应用 范围广。范围广。 2. 2.比耳比耳- -朗伯定律朗伯定律 a = ecl ea = ecl e1%1%1 1cmcm = = 10/m10/m 3. 3. 仪器校正和检定仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nmnm与与576.96576.96nmnm 或

14、用仪器中氘灯的或用仪器中氘灯的486.02486.02nmnm与与656.10656.10nmnm进行校正。进行校正。 吸收度的检定：用吸收度的检定：用k k2 2crocro7 7(60mg)+0.005mol/lh(60mg)+0.005mol/lh2 2soso4 4液至液至10001000mlml 波长波长( (nm) 235(nm) 235(最小最小) 257() 257(最大最大) 313() 313(最小最小) 350() 350(最大最大) ) e e1%1%1 1cmcm 124.5 144.0 48.62 106.6 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检

15、查：杂散光检查： 试剂试剂 浓度浓度( (g/ml) g/ml) 测定波长测定波长 透光率透光率(%)(%) nainai 1.00 220nm 1.00 220nm 0.8 0.8 nano nano2 2 5.00 340nm 5.00 340nm 0.8 0.8 4. 4. 对溶剂的要求对溶剂的要求: : 220 220240nm 241240nm 241250nm 251250nm 251300nm 300nm300nm 300nm以上以上 溶剂溶剂+吸收池吸收池a 0.41 0.41 0.20 0.20 0.10 0.10 0.050.05 5. 5. 测定方法测定方法 要求供试品溶

16、液的要求供试品溶液的a a应在应在0.3 0.3 0.70.7 对照品比较法：对照品比较法：c cx x=(=(a ax x/ /a ar r) )c cr r; ; 含量含量%=%=c cx xd/wd/w100 %100 % 常用方法常用方法 吸收系数法：吸收系数法： 计算分光光度法：计算分光光度法：（二）荧光分光光度法（二）荧光分光光度法 灵敏度高灵敏度高，可达，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在在低浓度低浓度进行测定，防止进行测定，防止f与与c不成正比及自熄灭作用不成正比及自熄灭作用 1. 特点特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减用基准物溶液校正仪器灵敏度，

17、防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但灵敏度高，但干扰因素多干扰因素多。 制备荧光制备荧光衍生物衍生物，可提高其灵敏度和选择性。，可提高其灵敏度和选择性。 用样品用样品量少量少，操作，操作简单简单，方法，方法快速快速，应用，应用范围范围较较广广。 2. 荧光分析仪荧光分析仪 有二个单色光器有二个单色光器激发单色光器与发射单色光激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3. 含量测定含量测定 常用的方法对照品比较法常用的方法对照品比较法:ci = (ri-rib)/(rr-rrb) c cr r ch.p收载收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷

18、片。地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。 三、色谱分析法三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类方法分类 按分离方法分为：按分离方法分为：pc；tlc；柱色谱；柱色谱；gc；hplc （一）（一）hplc法法 1. 对对hplc仪器一般要求仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：n = 5.54(tr /wh/2)2 2. 系统性试验系统性试验 分离度：分离度：r = 2（tr1 tr2)/(w1 + w2); 要大于要大于1.5 拖尾因子：拖尾因

19、子：t = w0.05h/2d1 应在应在0.9 1.05 重现性：重现性： 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例： rp-hplc法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法 （二）（二）gc法法 1. 对对gc仪器一般要求仪器一般要求 载气为载气为氮气氮气；色谱柱为填充或毛细管柱；色谱

20、柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：n = 5.54(tr /wh/2)2 2. 系统性试验系统性试验 分离度：分离度：r = 2（tr1 tr2)/(w1 + w2); 要大于要大于1.5 拖尾因子：拖尾因子：t = w0.05h/2d1 应在应在0.9 1.05 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例： ch.p(2000)收载的月桂卓酮、维生素收载的月桂卓酮、维生素e及其片剂、注及其片剂

21、、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用射剂、甲酚皂溶液等均采用gc法中的内标法加校正法中的内标法加校正 因子测定含量。因子测定含量。返 回 一、准确度一、准确度 是指用该方法是指用该方法测定结果与真实值接近的程度测定结果与真实值接近的程度，用，用回收回收率率表示表示（一）含量测定方法的准确度（一）含量测定方法的准确度 1. 原料药原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。建准确度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂制剂 要考察要考察辅料对回收率的影响辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中。采用在空白辅料中加入原料对

22、照品的方法作回收率试验，然后计算加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算rsd。 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证空白回收率空白回收率 空白空白+已知量已知量a的对照品（或标准品）测定，测定的对照品（或标准品）测定，测定值为值为m 加样回收率加样回收率 已准确测定药物含量已准确测定药物含量p的真实样品的真实样品+已知量已知量a的对的对照品（或标准品）测定，测定值为照品（或标准品）测定，测定值为m%100amr%100apmr（二）数据要求（二）数据要求 回收率回收率% = （测定值（测定值-空白值）空白值）/加入量加入量100%具体做法：测定高、中、低三个浓度，具体做法：测定

23、高、中、低三个浓度，n=3, 共共9个数据来评个数据来评价回收率的价回收率的rsd3 %；用用uv和和hplc法时，一般回收率要法时，一般回收率要求求95%105 % 二、精密度二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的结果之间的接近程度接近程度。 （一）精密度表示方法（一）精密度表示方法 1. 偏差偏差(deviation , d) 2. 标准偏差标准偏差（standard deviation, sd或或s） 3. 相对标准差相对标准差(relative standard deviation, rsd)也称变异系

24、也称变异系数数(coefficient of variation, cv) xxdi12nxxsi%100 xsrsd（二）重复性、中间精密度及重现性（二）重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性重复性 在相同条件下在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度。同设备测定结果的精密度。 3. 重现性重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求（三）数据要

25、求 应报告应报告s或或sd、rsd和可信限。用统计学的可和可信限。用统计学的可信性分析信性分析(t或或f）。）。 三、专属性三、专属性 是指在其他成分是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，可能存在下， 采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检 查、含量测定方法，均应考察其专属性。查、含量测定方法，均应考察其专属性。 （一）鉴别反应（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。的样品均应呈现负反应。（

26、二）含量测定和杂质测定（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。 四、检测限（四

27、、检测限（limit of detection, lod) 是指试样中被测物能被检测出的是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量最低浓度或量，是限，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。度或量即可。 五、定量限五、定量限（limit of quantitation, loq) 是指样品中是指样品中被测物能被被测物能被定量测定定量测定的最低量的最低量，其测定结，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求时，要求loq.常用信噪比法确定定量

28、限，一般以常用信噪比法确定定量限，一般以s/n=10时时相应的浓度进行测定。相应的浓度进行测定。 六、线性六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈呈正比正比关系的关系的程度程度。 uv法：首先制备标准系列，浓度点法：首先制备标准系列，浓度点n =5; a=0.30.7 建立回归方程建立回归方程c = aa + b ;r 0.9999。 hplc法：制备一个标准系列，浓度点法：制备一个标准系列，浓度点n =5 7; 以以c对对h或或a或与内标物的峰面积之比，建立回归方程或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r 0.999。七、

29、范围七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间适用的高低限度或量的区间。原料药和制剂含量测定原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的：范围应为测试浓度的80% 120%。制剂含量均匀度检查制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的：范围应为测试浓度的70%- 130%。溶出度或释放度中的溶出量测定溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的：范围应为限度的20%20%。 八、耐用性八、耐用性 是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受程度承受程度。典型的变动因素有：

30、被溶液的稳定性、样品提取。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。次数、时间等。 hplc法变动因素有：流动相组成与法变动因素有：流动相组成与ph，色谱柱，柱温，色谱柱，柱温，流速等。流速等。 gc法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。和检测器温度等。 分析方法效能指标的具体应用分析方法效能指标的具体应用： 1. 用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。 2. 用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法： 用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。 限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。 3. 原料、制剂及溶出度测定：不要求检测和