ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤细胞U87MG增殖的影响

1、ing4真核表达载体的构建及对胶质瘤真核表达载体的构建及对胶质瘤细胞细胞u87mg增殖的影响增殖的影响作者姓名（排序）：作者姓名（排序）： 李晓梅李晓梅 作者单位：作者单位： 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院哈尔滨医科大学附属肿瘤医院第一作者姓名及身份证号码：李晓梅第一作者姓名及身份证号码：李晓梅通讯作者姓名：通讯作者姓名： 耿敬姝耿敬姝研究背景 ings（inhibitor of growth肿瘤生长抑制因子）是近些年发现一个肿瘤抑制基因家族，包括ing1、ing2/ing12l、ing3、ing4 、ing5和三种酿酒酵母ings（yng1、yng2、及p

2、ho23）, 它们彼此之间保持较高的同源性。ing4基因是新近发现的ing基因家族的新成员，定位于人12q13-32，由8个外显子和7个内含子组成，编码248个氨基酸分子。其功能可能与负性调节细胞生长和接触抑制及血管生成有关。 国外研究发现，多种肿瘤中可发现存在ing4基因的异常或ing4蛋白表达的降低，如乳腺癌、直肠癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性胶质瘤及头颈部鳞状细胞癌等。 研究证实ing4 基因编码蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的增高而降低。ing4 基因在正常脑胶质细胞中比低度恶性脑胶质瘤中的表达水平高23倍，比高度恶性脑胶质瘤中的表达水平高6倍。我们有理由推测ing4基因的异常及蛋白

3、表达降低与胶质瘤发生发展有关。 已研究证实，该因子对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重要价值。为了进一步研究该因子对胶质瘤的治疗价值，我们首先构建真核表达载体pcdna3.1-ing4,并利用脂质体lipofectamine2000将其转入u87mg细胞，通过检测ing4基因的表达的改变及胶质瘤细胞u87mg细胞增殖所发生的改变，推测证实ing4对u87mg细胞增殖的影响，并进一步探讨ing4抑制肿瘤细胞增殖的机制是否与p53及cyclinb1有关。材料与方法1.ing4基因的克隆、序列测定和真核表达载体的构建 。 引物设计 扩增目的基因片段目的基因ing4克隆及真核载体pcdna3.1-ing

4、4的构建重组质粒的抽提纯化、测序和鉴定 。2. u87mg细胞培养、ing4基因转染、筛选和表达。 u87mg细胞采用dmem10%进口小牛血清培养用lipofectamine2000将pcdna3.1-ing4质粒和空载pcdna3.1质粒分别转染u87mg细胞在g418压力下筛选，建立稳定表达ing4细胞模型 提取转染ing4克隆细胞基因及总蛋白，挑选高表达ing4蛋白的u87mg细胞。 3. ing4对u87mg细胞增殖影响的多方面研究。 细胞计数及生长曲线绘制 细胞集落形成计数 mtt法检测细胞生长情况 观察ing4对胶质瘤细胞u87mg放射治疗的是否有增 敏作用 以上实验均以转染空载

5、质粒的细胞作为对照。 实验 给予6000gy 射线下连续照射。4. ing4抑制u87mg细胞增殖的机制的研究。 设计p53及cyclinb1 的引物，采用pcr进行基因扩增；应用western-blot方法 提取细胞中的总蛋白，检测分别转染目的基因ing4质粒及空载质粒u87mg细胞中ing4、p53及cyclinb1基因蛋白表达情况，均以gapdh为内参照。结 果1.经测序成功扩增出未发生基因突变的正确的ing4功能片段，大小为750bp。2. ing4在转染目的基因质粒u87mg细胞中的表达增高。 3.绘制生长曲线、集落形成试验、mtt检测显示转染ing4的瘤细胞生长受抑。见图1.2.3

6、4. ing4增强u87mg细胞对放射治疗的敏感性.见图4 .图1图2图3图45.转染ing4的u87mg细胞p53（图1）及cyclinb1（图2.3） 的表达降低。图1图2图3讨 论 gong等在2004年发现ing4是一种信号分子，可以调节细胞的存活、生长。ing4的表达在人神经胶质瘤组织中与正常脑组织比较是降低的，其表达水平由低级别肿瘤到高级别肿瘤是逐渐下调的，提示ing4表达下降可能与胶质肿瘤的发生有一定关系 。 我们构建ing4真核表达载体，转染低表达ing4的u87mg细胞，并通过与转染空载质粒的瘤细胞进行对照，发现无论是在基因水平还是蛋白水平转染ing4质粒的u87mg细胞能够

7、稳定高表达ing4蛋白。同时我们进行了几种反映肿瘤细胞生长增殖速度的实验，实验结果表明转染ing4的瘤细胞生长受到了明显的抑制，同时发现转染ing4瘤细胞在射线照射下致死率明显高于空载细胞，说明ing4能够抑制胶质瘤细胞的生长，可以提高瘤细胞对射线的敏感性。 ing4是一种核蛋白，其c端具有核定位信号与p53复合定位于细胞核内。p53是一种多功能蛋白，它的基本功能是作为转录反式作用因子调节转录活性。研究表明ing4功能的发挥是p53依赖的，在我们的研究中发现转染ing4质粒后瘤细胞中p53的表达没有增加，是降低的，这说明ing4不是p53的上游基因，ing4表达增强并不引起p53水平增高，可能

8、通过调节p53下游某种基因的表达来抑制瘤细胞增殖 shiseki等发现在转染ing4的rko细胞株48小时后ing4基因的高表达引起s期细胞数量减少，以及g1/s和g2/m期细胞数量增加，说明抑癌基因ing4可能引起瘤细胞g1/s期和g2/m期发生阻滞 细胞的分裂是由一组称为细胞周期素cyclin的蛋白和一组依赖于cyclin的蛋白激酶cdk及其抑制物cdki所调控的。其中，cyclinb1是细胞周期g2/m检测点关键的调控因子。人类多种肿瘤发现有cyclinb1过表达，高表达的cyclinb1不断促进肿瘤细胞分裂和增殖，是肿瘤细胞增殖的重要因素。 我们用rt-pcr及western-blot方法分别检测稳定转染ing4瘤细胞和转染空载质粒瘤细胞中cyclinb1的基因转录及翻译情况，结果显示稳定转染ing4的细胞cyclinb1明显降低，也就是可能由于瘤细胞高表达的ing4蛋白抑制了cyclinb1基因的转录和翻译，从而提示高表达ing4蛋白抑制细胞生长，可能是由于降低p53下游的cyclinb1的表达来实现的。 综上所述，我们的研究结果显示，高表达ing4蛋白可抑制胶质瘤细胞的生