_王震_几种辣根过氧化物酶底物的合成

1、.中国药科大学本科生毕业论文（设计)中国药科大学本 科 毕 业 论 文论文题目 几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成英文题目 synthesis of several substrate for horseradish peroxidase 专 业 制药工程院 部 工学院学 号 1143206姓 名 王震指导教师 孙海鹰课 题完成场所 中国药科大学江宁校区论文工作时间： 2015 年 3 月 至 2015 年 6 月;几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成目录摘要1前言2第一章 辣根过氧化物酶底物的发展41.1 色原底物41.2 荧光底物41.3 常见的化学发光底物51.3.1鲁米诺化学

2、发光体系51.3.2过氧草酸酯类71.3.3吖啶及其衍生物7第二章 吖啶环上无取代吖啶酯的合成92.1引言92.2 操作过程102.2.1 N-苯基茜素的合成102.2.2 吖啶-9-羧酸的合成102.2.3 吖啶-9-酰氯的合成112.2.4 两种吖啶-9-羧酸苯酚酯衍生物的合成112.2.5 9-苯氧羰基-10-吖啶三氟甲基磺酸盐的合成122.2.6 还原反应12第三章 吖啶环上有取代吖啶酯的合成143.1 引言143.2 操作过程143.2.1 异亚硝基乙酰对甲苯胺的合成143.2.2 5-甲基靛红的合成14参考文献16致谢18几种辣根过氧化物酶(HRP)的底物的合成1143206 王震

3、摘要：辣根过氧化物酶是一种以亚铁血红素为氧化还原中心的过氧化物酶，从辣根等植物的根部提取而来，现在已经被广泛地应用在免疫分析、医学检测、荧光分析等众多领域。化学发光试剂是辣根过氧化物酶常见的一类底物，其中吖啶酯及其衍生物又是一类常见的高效化学发光试剂，因此本文中主要探索了两类吖啶酯衍生物的合成方法，并具体介绍了三个化合物的合成。关键词：辣根过氧化物酶，化学发光底物，吖啶酯，合成Synthesis of several substratefor horseradish peroxidaseAbstract:Horseradish peroxidase extracted from the pla

4、nts of horseradish roots, is a kind of peroxidase of heme as the Redox centers and widely used in the immunoassay, biomedical testing, fluorescence analysis.Chemiluminescent substrate is a common substrate for horseradish peroxidase, Acridine ester is a kind of efficient chemiluminescence, Therefore

5、, this article is mainly designed to synthesize two series of acridinium ester, The first is no substituent groups onthe acridine ring, Including two compounds; The second acridinium ester that has substituents on the acridine ring.Keywords: horseradish peroxidase, chemiluminescent substrate, acridi

6、nium ester, synthesis前言 辣根氧化物酶由辣根等植物的根部提取而来，是一种含糖量为18%，分子量为44000D的糖蛋白。辣根过氧化物酶分子的氧化还原中心为亚铁血红素，辣根过氧化物酶对芳香族等化合物具有良好的催化氧化性能。相比较于其他过氧化物酶来说，辣根过氧化物酶有其自身的优点，如原料易得,市场价格比较便宜,作用底物十分宽泛等,这使得辣根过氧化物酶成为过氧化物酶中应用十分广泛的一种酶。现在，辣根过氧化物酶已广泛应用于各个领域之中，在免疫分析、有机合成、食品分析等方面，辣根过氧化物酶都发挥了重要的作用。例如在有机合成之中，可作为催化剂使用,对苯胺、酚类等芳香族化合物都具有很高的

7、催化效能；在酶免疫分析检测中,辣根过氧化物酶具有化学发光底物,因此而建立的化学发光免疫测定在临床中得到广泛应用【2】。化学发光分析检测灵敏度高、本底低, 因此作为辣根过氧化物酶的底物的化学发光试剂的研究和制备是化学发光免疫检测的热点。其中吖啶酯衍生物是一种常见的化学发光试剂【2】，因此本论文研究的目的是对两种吖啶酯衍生物的合成方法进行探索，合成三种不同的吖啶酯的衍生物，并在将来的工作中对各种吖啶酯的化合物的发光性能进行研究。第一章 辣根过氧化物酶的底物发展【3】1.1 色原底物最早发现的辣根过氧化物酶的底物是色原，色原底物经过酶的作用会产生一种新的颜色或其吸收光谱产生变化，这种检测方法所产生的

8、颜色很容易用肉眼或光谱仪器观测到是它最大的优点，对比之下，检测仪器所需的价格较其他检测方法更加便宜，但检测灵敏度较其他检测方法来说较低是其不足之处。不同取代的芳香族胺和酚可以用来表示色原底物的基本结构，在酶促氧化的过程之中，大多数不同取代的芳香胺、酚类或者它们的混合物会产生有颜色的缩聚物，易于观测。下面简单介绍几种常见的芳香族胺类色原底物:如四甲基联苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)、邻联甲苯胺(OT)等，这三种色原底物的结构如下图所示：1.2 荧光底物继色原底物之后，荧光底物的发现丰富了辣根过氧化物酶的的底物发展，荧光底物检测灵敏度比色原底物更高,更重要的是，荧光底物可以同时采用几种

9、不同颜色的荧光材料，但与此同时，荧光底物也存在着其自身的缺点: 首先，荧光的激发和检测所需要的光源、过滤器和扫描仪等设备价格昂贵，相对色原底物来说，检测成本更高；其次，经由细胞或着其他分子产生的自发荧光同样会对实验的结果产生干扰；再次，在观测期间、样品存放期间、或者暴露于室内光线时，荧光会发生衰减, 导致实验难以获得恒定数据。1.3 常见的化学发光底物继荧光底物之后，化学发光底物的发现使得辣根过氧化物酶的底物发展进入一个快速发展的阶段，各种化学发光底物极大丰富了辣根过氧化物酶的应用。化学发光指的是物质分子在化学反应的过程当中吸收来自反应的能量，并以光的形式将能量释放出来的一种形式。化学发光的发

10、光机理反应体系中某些物质吸收了来自反应所释放的化学能，然后物质分子从基态跃迁到激发态，当从激发态重新恢复到基态的状态时，反应体系所吸收的能量会以光的形式释放出来，从而产生发光现象。顾名思义，化学发光是指在化学反应的过程中所产生的化学能被吸收使分子激发而发射的光，荧光则是吸收了光能使分子激发而发射的光，这就是化学发光与荧光的区别所在，暨二者形成激发态分子的激发能的形式不同，一种为化学能，一种为光能。一般来说，化学发光底物具有高能化学键，酶的作用下，化学键会发生断裂，能量以可见光的形式释放。化学发光所需的检测仪器价格昂贵，发射光须随时采集，难以得到恒定值，但化学发光检测灵敏度高、背景低, 因而得到

11、广泛应用【4】。下面简单介绍几种常见的化学发光底物，包括鲁米诺类、过氧草酸酯类，以及吖啶酯类，它们在实际的化学分析测定中是常用的几种化学发光试剂，在药物分析，环境监测等领域也有着重要的应用：1.3.1鲁米诺化学发光体系鲁米诺，化学名为3-氨基邻苯二甲酰肼，其结构简单易于合成、性质稳定、水溶性好、环境友好且无毒，是应用最多的化学发光试剂之一，并以研究最多、化学发光效率高而著称【5】。鲁米诺作为一种常用的化学发光试剂可以用于多种物质的分析检测，如过氧化氢酶、辣根过氧化酶、铁盐、过渡金属离子等均可以作为氧化剂或催化剂增强鲁米诺的化学发光。上述物质通过影响鲁米诺的化学发光速率，而进一步影响鲁米诺的化学

12、发光强度，因此，鲁米诺可以用于上述物质的检测【6】。虽然鲁米诺可用于多种物质的分析检测，但至今为止，鲁米诺的化学发光机理仍未阐释清楚，主要原因在于捕获和分离反应中间体十分困难，所以，机理中仍然有一些细节难以明确。下面给出鲁米诺的一种可能的化学发光机理：如图展示了一种可能的鲁米诺的发光机制【7】：该机制经历四个阶段：第一阶段：luminol® LH -（luminol 在碱性环境作用下，生成 LH - 阴离子）；第二阶段：LH - L -（LH .）（LH - 阴离子在氧化剂的作用下，生成 LH。自由基或L- 阴离子）；第三阶段：L - LHOOH（L- 自由基在过氧化物的作用下，生成

13、 LHOOH）；第四阶段：LHOOH 3-氨基邻苯二甲酸根负离子*+N2（LHOOH脱去 N2，生成 3-氨基邻苯二甲酸根负离子的激发态物质），最后，激发态物质回到基态的过程中，产生化学发光【8】。鲁米诺可以用于多种类型的离子的测定，例如可以用于金属离子的含量测定，关于测定海水中铁离子含量的方法已经建立起来，并应用于海洋环境监测之中；与此同时，在过渡金属检测和碱土金属离子检测方面，鲁米诺化学发光体系也发挥了重要的作用；当然除了过渡金属离子和碱土金属离子之外，过渡金属配合物也影响金属的催化特性，因此鲁米诺也可以用于过渡金属配合物的检测。因此根据以上原理，可以通过鲁米诺化学发光体系建立各种离子的的

14、检测方法。另外，以鲁米诺为化学发光试剂的化学发光免疫分析方法现以广泛应用于环境监测，药物分析，食品分析等领域【9】。1.3.2过氧草酸酯类过氧草酸酯类是一种常见的化学发光试剂，最早被发现的过氧草酸酯类化学发光体为草酰氯，后来，科学家们发现草酸酯和草酰氯一样具有化学发光的性质，与草酰氯相比，草酸酯更为稳定，发光效率也更好。因此，更多的过氧草酸酯类物质被应用于化学发光检测。与鲁米诺化学发光试剂相比较，过氧草酸酯类有其自身的优点。首先，过氧草酸酯类化学发光试剂有较高的量子产率和灵敏度；其次，化学反应之中可能存在的金属离子或阳离子等，对过氧草酸酯类发光的影响很小，这使得检测体系的发光效率显著提高。与荧

15、光底物相比，以过氧草酸酯为发光试剂的化学发光法的谱图更加简单，选择性更好，这大大提高了过氧草酸酯类化学发光试剂的应用范围。再次，在过氧草酸酯分子中，亚硝酸根作为离去基团，很容易脱去，因而使得反应的速度快，整个发光体系的发光强度更大。到目前为止，尽管科学家们已经对化学发光进行了大量深入的研究，也有不少学者提出各种各样的反应机理，但由于草酸酯类化学发光反应活性中间体的寿命太短，难以捕捉和监测，导致现在对于草酸酯类化学发光的机理一直没有可靠地统一的解释，故在本文之中对此不做过多的介绍【10】。1.3.3吖啶及其衍生物吖啶类及其衍生物是一种用途广泛的高校化学发光试剂，也是本文所要介绍的重点内容【11】

16、。吖啶酯、吖啶磺酰胺以及光泽精等是常见的吖啶类化学发光试剂，在本文中，光泽精和吖啶磺酰胺不做过多介绍，主要介绍吖啶酯及其衍生物【12】。吖啶酯的通式如下图所示：吖啶酯作为一类高效的化学发光试剂，具有很多的优点：首先，吖啶酯具有较高的量子产率，与鲁米诺相比，其化学发光效率是鲁米诺的五倍甚至更多；其次，吖啶酯的性质更加稳定，受反应体系中其它物质的影响也更小，储存方便。再次，吖啶酯的化学发光过程反应速度快，在过氧化氢或其他过氧化物的存在下存在的情况下即能引起发光【13】。吖啶酯及其衍生物可实现抗原、抗体及DNA等生物大分子的化学发光分析，是一种性能优良的化学发光免疫分析标记试剂【14】。其主要作用原

17、理是通过分子结构上所特有的取代基团与生物大分子上的氨基、羧基或磷酸基团直接或间接作用，从而标记这些生物大分子。同鲁米诺化学发光体系和过氧草酸酯类化学发光试剂不同的是，吖啶酯类的化学发光机理已经得到了基本确认。科学家们认为，吖啶酯化学发光的关键在于吖啶酯在碱性条件下与过氧化氢相互作用形成过氧化合物的活泼中间体，然后再在电激发的条件下转化为稳定的终产物：吖啶酮，同时能量以光的形式释放出来。如下图所示即为吖啶酯的化学发光机理【15】：吖啶酯化学发光反应机理的特点反应光淬灭的效应较小，而且反应过程中的发光基团的解离、发光效率等都不会受到连接臂长短的影响。我们可以通过对吖啶酯的结构进行改造，从而探究影响

18、吖啶酯发光效率的因素，并合成具有更好发光强度的吖啶酯类化合物。设计并合成不同类型的吖啶酯，深入研究吖啶酯的化学发光规律，为化学发光分析提供更加优良的化学发光试剂都具有重要的意义【16】。因此本文以上述内容为基础，主要设计了两种吖啶酯衍生物的合成，一种是吖啶环上没有取代基团的吖啶酯衍生物的合成，另一种是吖啶环上有甲基取代基团的的吖啶酸的合成。本文下面两个章节将分别对这两种吖啶酯的衍生物的设计及合成做出详细描述，以供大家交流学习。第二章 吖啶环上无取代吖啶酯的合成2.1引言在吖啶酯的合成过程之中，吖啶-9-羧酸是重要的中间体，因此吖啶-9-羧酸的合成非常重要。通过参考相关文献文献，得到常用于合成吖

19、啶环无取代的吖啶-9-羧酸的常用方法有二种，分别是：1. 以二苯胺为起始原料，在甲苯作溶剂的情况下与草酰氯反应得中间体 N-苯基茜素，然后N-苯基茜素在强碱的作用下重排得到吖啶-9-羧酸。2.以吖啶作为起始合成原料，其与氰化钾发生反应，先制得 9-氰基吖啶，然后水解即可得到吖啶-9-羧酸。在方法二中，合成吖啶-9-羧酸需要使用氰化钾，氰化钾是一种剧毒品，会对环境及人体造成严重危害，且吖啶价格较为昂贵，故不宜采用。而方法一中原料二苯胺易得无毒，合成简单，故在此次实验中，采用方法一中的路线进行吖啶-9-羧酸的合成。这样吖啶环上无取代的吖啶酯的合成路线即基本确定。路线简述如下：在此次实验之中，选择以

20、二苯胺为起始合成原料，以甲苯为溶剂，与草酰氯反应得到N-苯基茜素；N-苯基茜素在强碱的作用下发生重排，得到重要的中间体：吖啶-9-羧酸。因为吖啶-9-羧酸的性质较稳定，故在本次实验中，先做出了较大量的吖啶-9-羧酸（约15g），放置备用。而后分别称取一定量的吖啶-9-羧酸与二氯亚砜作用生成酰氯，酰氯再分别与苯酚、2，3,6-三氟苯酚反应，生成两种不同的吖啶酯衍生物。两种吖啶酯衍生物继续与三氟甲磺酸甲酯反应生成盐类，然后在锌粉和氯化铵的作用下还原生成二氢吖啶酯衍生物。2.2 实验步骤2.2.1 N-苯基茜素的合成称取20g二苯胺，将其溶于50ml甲苯之中，然后缓慢加入12ml草酰氯，冰水浴下反应

21、，维持温度在10以下，反应呈棕色的悬浮液。待反应毕，将液体油浴加热至55至65之间，溶液呈亮黄色，由于加热过程可能会产生大量氯化氢气体，故在茄形瓶上加一个气球，以收集产生的氯化氢气体。反应完全之后，萃取减压浓缩得22g N-苯基茜素，该步产率为84.6%。2.2.2 吖啶-9-羧酸的合成称取11g氢氧化钾，加适量水溶解，然后加入到茄形瓶中，与上一步所得到的22gN-苯基茜素反应，油浴加热至回流。反应过程中，通过TLC检测发现，反应未反应完全，故又加入了两个当量的氢氧化钾，待反应完全，将溶液调至酸性，抽滤干燥得粗品吖啶-9-羧酸17g。然后将所得粗品溶于10%的碳酸氢钠水溶液中，用浓盐酸小心沉淀

22、，过滤，干燥得金黄色固体，称重得精品吖啶-9-羧酸15.5g，此步产率为70.4%。2.2.3 吖啶-9-酰氯的合成因此次实验需合成两种不同的吖啶酯，故从该步反应开始，开始分为两个路线进行反应，一条路线用于合成吖啶-9-羧酸苯酚酯，另一条路线用于吖啶-9-羧酸-2，3,6三氟苯酚酯。现分别以、标注两条合成路线 ，具体的实验步骤如下所述： 称取1.30g吖啶-9-羧酸，将其溶于适量二氯亚砜中，加入一滴DMF，油浴加热搅拌至回流，反应搅拌过程中溶液呈成红棕色，反应3小时，将液体减压浓缩得到吖啶-9-酰氯。因反应所得酰氯性质较活泼，故不可久置，尽快投入到下一步反应之中去。 称取1.00g吖啶-9-羧

23、酸，将其溶于适量二氯亚砜中，加入一滴DMF，油浴加热至回流，反应过程中溶液呈红棕色，搅拌3小时，将液体减压浓缩得吖啶-9-酰氯。因反应所得酰氯性质较活泼，故不可久置，尽快投入到下一步反应之中去。2.2.4 两种吖啶-9-羧酸苯酚酯衍生物的合成 将上步反应所得吖啶-9-酰氯于20ml吡啶中溶解，再加入500mg苯酚室温下搅拌进行反应，反应过夜，于第二天处理。待反应毕，加水溶解，乙酸乙酯萃取，干燥减压浓缩用二氯甲烷做展开剂进行硅胶柱色谱分离。该步反应由于加入的吡啶较多，用水萃取难以将吡啶除去，减压浓缩也不能将吡啶除尽，故尝试了两遍硅胶柱色谱分离都未能将所需化合物与吡啶完全分离。而后通过干法上样将所

24、需化合物与吡啶分离，旋干得到物质780mg，其中留一管打核磁以确定产物，经确定，所得物质为吖啶-9-羧酸苯酚酯，该步反应产率为51.1%。 将上步反应所得吖啶-9-酰氯溶于13ml吡啶之中，再加入500mg 2,3,6-三氟苯酚，室温下搅拌过夜，于第二天进行处理。待反应毕，用稀酸溶解，乙酸乙酯萃取（因为吡啶是碱，所以用稀酸可以将其成盐带走，故用稀酸可处理掉多余的吡啶）。干燥旋干后用二氯甲烷做展开剂，通过干法上样进行硅胶柱色谱分离，将所需物质分离出来，旋干称重得830mg，打核磁确定该物质为吖啶-9-羧酸-2,3,6-三氟苯酚酯，该步反应产率为68.8%。2.2.5 9-苯氧羰基-10-甲基吖啶

25、三氟甲基磺酸盐的合成 称取上步反应产物吖啶-9-羧酸苯酚酯80mg溶于8ml二氯甲烷中，加入4、5滴三氟甲磺酸甲酯，氩气保护下，室温搅拌过夜。待反应毕，抽滤，干燥，得固体产物124mg。 称取上步反应产物吖啶-9-羧酸-2,3,6三氟苯酚酯100mg溶于10ml二氯甲烷之中，加入300mg三氟甲磺酸甲酯，氮气保护下，室温搅拌过夜。待反应毕，抽滤，干燥得固体产物147mg。2.2.6 还原反应将上步反应所得的124mg 9-苯氧羰基-10-吖啶三氟甲基磺酸盐溶于适量的乙醇之中，依次加入56mg的氯化铵，83mg的锌粉，氩气保护下进行反应，搅拌加热回流45mins，锌粉的加入会使溶液迅速脱色，由黄

26、色变成灰白色，抽滤减压浓缩得灰白色固体。将所得固体溶于二氯甲烷，萃取减压浓缩，用石油醚：乙酸乙酯=50:1进行硅胶柱色谱分离，分离得到所需化合物。其中留下一管打核磁确认产物，经确认，所得物质为所需化合物。 将上步反应所得的盐溶于适量的乙醇之中，依次加入66mg的氯化铵，98mg的锌粉，氮气保护下进行反应，搅拌加热回流45mins，锌粉的加入会使溶液迅速脱色，由黄色变为灰白色，抽滤减压浓缩得油状液体，将液体溶于二氯甲烷，萃取减压浓缩，然后用石油醚：乙酸乙酯=50：1进行硅胶柱色谱分离，分离得到50mg所需化合物。打核磁确认产物，经确定，所得物质为所需化合物。第三章 吖啶环上有取代吖啶酯的合成3.

27、1 引言在此次实验中，以对甲苯胺为起始合成原料，对甲苯胺在无水硫酸钠溶液中，与水合氯醛、浓盐酸以及盐酸羟胺反应，生成粗品异亚硝基乙酰对甲苯胺。然后将粗品精制，并将其投入到加热的浓硫酸之中，然后升温至90反应，后处理后得到5-甲基靛红。5-甲基靛红继续与定量的苯硼酸、乙酸铜一起溶于二氯乙烷之中，在加入适量的三乙胺室温下反应得到苯环上有取代的N-苯基茜素。然后甲基取代的N-苯基茜素在强碱的作用下重排得到2-甲基吖啶-9-羧酸。3.2 操作过程3.2.1 异亚硝基乙酰对甲苯胺的合成首先，称取3g无水硫酸钠，加热溶于20ml水中，依次加入1.43g对甲苯胺、1ml浓盐酸及1.41g盐酸羟胺，油浴加热，

28、温度维持在140至160之间，待反应完毕后，抽滤，将滤饼水洗，称重得粗品异亚硝基乙酰对甲苯胺1.12g，该步反应的产率为92.5%。精制：将上步反应所得的1.12g粗产品溶于126ml 1%的氢氧化钠溶液中，过滤，滤液用3N的盐酸中和，溶液中会析出白色粉状沉淀，调至pH值为6-7。然后，抽滤，将滤饼水洗、干燥，称重，得到0.95g精制的异亚硝基乙酰对甲苯胺。3.2.2 5-甲基靛红的合成 首先，将5ml浓硫酸加入到50ml茄形瓶中，油浴加热至100。然后将上步反应所得的0.95g化合物于10mins之内加入到浓硫酸中，继而升温至150，反应20mins。接着冷却至30以下，倒入20ml水中，水

29、解约20mins，再冷却至15以下，抽滤，用冰水洗涤三次，滤饼干燥、称重得5-甲基靛红650mg，该步产率为75.6%。3.2.3 2-甲基N-苯基茜素的合成称取上步反应所得的5-甲基靛红50mg，与57mg苯硼酸和65mg乙酸铜一起溶于适量的二氯乙烷中，然后再加入63mg的三乙胺，室温下搅拌反应，待反应完全后，萃取减压浓缩得到2-甲基N-苯基茜素60mg，该步产率为81.1%。3.2.4 2-甲基吖啶-9-羧酸的合成称取40mg氢氧化钾，加适量水溶解，与上一步所得到的60mg2-甲基N-苯基茜素反应，油浴加热至回流。反应过程中，通过TLC检测，待反应完全，将溶液调至酸性，抽滤干燥得2-甲基吖

30、啶-9-羧酸44mg，该步产率为73.3%。参考文献1WO 2006/073424 A22朱敏,黄雪梅,沈含熙.辣根过氧化物酶在分析化学中的应用J.分析科学学报,1999,05:418-424.3戚红卷,陈苏红,王升启.辣根过氧化物酶(HRP)底物的研究进展J.军事医学科学院院刊,2007,06:560-563.4穆小静,夏之宁.化学发光试剂的结构修饰及化学发光性能研究进展J.化学通报,2009,03:195-201.5展海军,王华芳,孔德玉.辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化不同底物的动力学试验A.河南省化学会.河南省化学会2010年学术年会论文摘要集C.河南省化学会:,2010:1.6洪伟杰,张朝晖,芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制J.生命的化学,2005,01:33-36.7李金明,叶应妩,林其燧.辣根过氧化物酶及其在酶免疫试验中的应用研究进展J.国外医学.临床生物化学与检验学分册,1993,05:217-221.8张丽华,蒋俊峰.辣根过氧化物酶酶学特性及应用进展J