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文档简介

1、实验四用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系一、目的1、了解袁隆平的杂交水稻三系配套和杂种优势利川的基木理论。2、遗传标记川于水稻三系及杂种f1间亲缘关系的初步鉴定的棊本原理3、初步掌握pcr和琼脂糖凝胶电泳技术二、原理1、三系配套、杂种优势和遗传标记用于水稻品种亲缘关系鉴定的基本理论和原理植物在牛长发育过程屮,由于受环境条件影响或自身遗传突变导致雄性牛殖系统退化不 能产牛花粉或者产牛的花粉缺乏正常的功能,而雌性牛殖系统发育正常的-种牛物学现象, 称为雄性不育。植物雄性不育在自然界普遍存在,据统计,已经在43个科、162个属、320 个种的617个种和种间杂种中发现了雄性不育现象(徐秉芳,2000)

2、。如果雄性不育遗传方 式符合孟德尔遗传规律的,称核雄性不育(genic male sterility,简称gms);如果以母性方 式遗传,贝ij称之为细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility»简称cms) (kaul, 1988)«袁隆平的最大贡献在于最早实现生产上大面积应用的杂交水稻三系配套。所谓的杂交水 稻三系是指(细胞质)雄性不育系(a表示)、保持系(b表示)和恢复系(r表示),不育 系是以细胞质母性方式遗传的,不育基因现在基本确定是线粒体基因。不育系与强恢复系杂 交后经人工选择可获得产量、品质和抗病性等均有明显超越亲本性状的杂种f1代,可

3、川于 生产应川,这就是杂种优势利用。可是,不育系(a)本身不育,一季后就无法大量保存(可 以用稻兜保存),牛产上也就无法人面积应用。保持系(b)与不育系杂交则能结种子,而且 结的种了在长成植株后又是与原來的不育系完全是一样的,也就是保持系(b)能使不育系 大量地繁殖以适合于生产应用。不育系(a)与保持系(b)的区别基本上是不育系存在不育基因,而保持系不存在不 育棊因。恢复系(r)与不育系(a)基本上是毫不相关的品种,当然恢复系也是没冇不育 棊因的。不育系的不育基因基本确定是线粒体(细胞质)基因,因而不育系(a)与恢复系 (r)杂交后代f1应该含冇不育基因,f1长成植株后本身是可育的,主要原因是

4、恢复系提 供的细胞核基因能恢复它的育性。生产上应用的是f1杂交种了,而生产f1杂交种了成本较高,因而商业经营上町能会冇 人以恢复系(恢复系本身往往是曾经或正在牛产上应用的品种,自交收种子就行,成本低) 代替。为了大致区分水稻细胞质雄性不育系(a)、保持系(b)、恢复系(r)和杂种f1种 子,我们可以根据已知的不育系(a)的不育基因设计引物,分别以a、b、r和f1全基因 组dna为模板,经过pcr和电泳检测,有口的pcr产物带的是不育系a和杂种f1,无目的 带的是保持系b和恢复系r,这样就棊本上可以将杂种f1与恢复系r初步区分出來。2、pcr反应原理pcr (polymerase chain r

5、eaction)即聚合酶链式反应,它是近年发展起來的一种体外扩 增特定冃的dna片段的技术。pcr技术实际上是在模板dna、引物和4种脱氧核糖核tf酸 (dntp)存在的条件下依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。pcr技术的特异性取决于引物和模 板dna结合的特界性。反应分3步:变性:通过加热使dna双螺旋的氢键断裂,双链 解离形成单链dna:退火:当温度突然降低时,由于模板分了结构较引物要复杂得多, 而r反应体系中引物dna量大大多于模板dna,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链, 而模板dna双链z间互补的机会较少。延伸:在dna聚合酶和4种dntp底物及mg2+ 存在的条件下,5->

6、;3*的聚合酶催化以引物为起始点的dna链延伸反应。以上3步为一个循 坏,每一循坏的产物可以作为卜一个循坏的模板,2-3小时之后,介于两个引物之间的特定 目的dna片段得到了人量复制,数量可达2x1067拷贝。3、琼脂糖凝胶电泳检测的基本原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它己成为 分了生物学技术中分离生物大分了的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵 敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在ph值为8.0-8.3时,核酸分子碱基儿乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电, 在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用

7、卜使分 子人小和构象不同的核酸分子泳动率岀现较人的茅界,从而达到分离核酸片段检测具大小的 目的。核酸分子屮嵌入荧光染料(如eb)后,在紫外灯卜可观察到核酸片段所在的位迸。三、材料粤泰a、粤泰b、9311 (恢复系r)和红莲优6 (杂种f1)的全基因组dna。四、主要的器具、药品试剂主要仪器设备:pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉主要药品试剂:pcr反应:1. 上下游引物:浓度为各10pmol/ulof: atg gca aat ctg ctc cga tgg ctcr: tta ctt agg aaa gac tac acgorfh79sequence:(不育基因序列)atgacaaatc

8、tgctccgatggctcttctccactacccgagggactaacggtcttccatatttcatcttcggtgtc gttgtaggaggcgccctgttgtttgctttgctaaagtatcaggcccctctgtacgacccggctttattggacaaa atcatagatcataatataaaagccgggtaccctatagaggttgactattcgtggtggggcacctctattcgtgta gtctttcctaagtaa2. dna模板浓度为1 oong/ulo3. 10xbuffer (购买 taq 酶配套 buffer) : 500mmol/l k

9、cl 1 oommol/l tris-cl, ph9.0,1 % triton-x 1004. mgci2: 25mmol/lo5. dntp 2.5mmol/l:分别取等体积 lomol/l 的 datp, dgtp, dttp, dctp 混合即成6. taq dna聚合酶:浓度为2.5u/1h。7. 灭菌双蒸水 电泳:1. 琼脂糖2. 6x载样 buffer 0.25% 二甲苯青 ff, 0.25% 澳酚蓝,30% lt油3. 50xtae 电泳 buffer 12.2g tris, 2.85ml 冰醋酸,10ml 0.25 mol/l edta(phs.o), 加水至50ml o4.

10、浪化乙锭(eb)溶液10mg/ml(m光保存),每100ml琼脂糖凝胶加5 p 1贮存液,即凝胶中eb终浓度为0.5ug/ml,此试剂为强致癌物,要戴手套操作,避免污染环境。5. dna marker:共 6 条带,2000bp、looobp、750bp、500bp、250bp、loobp。上样 6ul时750bp的带约为loong,其余带约为50ng6. 各种国产移液器(10, 20, 100叮)7. 消毒的tips枪头8. 水平电泳槽和电泳仪五、实验操作(一)pcr:各种试剂置冰盒中,取已灭菌的0.2ml pcr管,于冰上按下表操作:(20,反应体系)用枪混匀反应液,稍离心,盖紧盖子,编号

11、。于pcr仪上进行pcr反应。试剂加入量终浓度(或含量)dna模板2ulloong10 x buffer4n 11 x bufferdntp2ul25mmolmgcl21 ul约 2.5mm/l上下游引物2u 1 (各 l()pmol/u 1)各 1 opmoltaq dna聚合酶1 u 1(2.5 u/ u 1)1.25u无菌ddh2o补足20 pl总体积20 ul反应程序设置为:94°c预变性 5min以下35次循环94°c变性30s55 °c退火30s72 °c延仲60s循环后72 °c5 min(二)、琼脂糖凝胶电泳检测1、胶液的制备:

12、称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1xtae稀释缓冲液,放电 炉上加热至琼脂糊全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程屮要不时摇动, 使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间,将胶槽置于水 平支持物上,插上样需梳了,注意观察梳了齿下缘应与胶槽底而保持1mm左右的间隙。用移液 器吸取少虽融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入 胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶吋的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不nj太快, 否则容易岀现气泡。待胶完全凝固后拨

13、出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向杷内加入 1xtae缓冲液至液而恰好没过胶板上表而。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲 液进入样品槽屮,所以要注意保证样品槽屮应注满缓冲液。4、加样:取1»1 pcr产物dna溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。pcr产物加样完毕,选取一个未加样点样孔加入6ul dna markero注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品 槽底部凝胶刺穿。5、电泳:加完样示,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5v/cm。当漠酚蓝 条带移动到距凝胶前沿约2lcm时,停止电泳。6、染色:未加eb的胶板在电泳完毕后移入0. 5 u g/ml的eb溶液屮,室温下染色2025 分钟。7、观察:在波长为254nm的长波长紫外灯卜观察染色后的电沐胶板。dna存在处显

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