小鼠脑组织病理总结ppt课件

1、1小鼠脑组织病理实验总结小鼠脑组织病理实验总结2内容内容石蜡切片的制作石蜡切片的制作冰冻切片的制作冰冻切片的制作免疫组化免疫组化免疫荧光免疫荧光HE病理相关试剂配制病理相关试剂配制注意事项注意事项3石蜡切片的制作石蜡切片的制作取材和固定：取材和固定： 处死动物后或者灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中。处死动物后或者灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中。脱水和透明：梯度酒精和二甲苯脱水和透明：梯度酒精和二甲苯浸蜡和包埋：石蜡浸蜡和包埋：石蜡切片制作：切片切片制作：切片贴片：捞片，展片贴片：捞片，展片保存：烤片保存：烤片4冰冻切片的制作冰冻切片的制作取材和固定：取材和固定： 灌注后立即切

2、取组织块，并快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。脱水和透明：梯度蔗糖脱水和透明：梯度蔗糖包埋：包埋：OCTOCT，3%3%聚乙烯醇。聚乙烯醇。切片制作：切片切片制作：切片贴片：直接贴贴片：直接贴固定：冰冻丙酮固定：冰冻丙酮3-53-5分分保存：保存：-20-20C C5灌注灌注 0.5%戊巴比妥钠戊巴比妥钠100mg/Kg麻醉小鼠，麻醉小鼠，5分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉层，剑突上成棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉层，剑突上成V型剪开胸

3、廓，暴露心脏，剪掉型剪开胸廓，暴露心脏，剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组织），与心尖处右心耳（即视野下心脏上色暗红组织），与心尖处30角刺入左心室，角刺入左心室，37左右生理左右生理盐水约盐水约10ml缓慢注入，冲净血液止，换缓慢注入，冲净血液止，换4%多聚甲醛溶液（多聚甲醛溶液（4预冷），预冷），10-20分钟，鼠分钟，鼠僵硬为好。僵硬为好。6固定固定4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同，几小时到一周。多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同，几小时到一周。我曾用过我曾用过2天，可以。天，可以。冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预防甲醛沉积。冲水，固定的时间越长

4、冲水时间越长，预防甲醛沉积。7取脑取脑 断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开露断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组织，厚织，厚3mm左右。左右。8脱水和透明，浸蜡脱水和透明，浸蜡石蜡切片：石蜡切片：75%，80%，85%，90%，95%（2个），无水乙醇（个），无水乙醇（2）中每个）中每个4小时小时-过夜，过夜，正丁醇正丁醇1-2天。二甲苯（天。二甲苯（2个）个）20-30分

5、钟。三个蜡，每个大于分钟。三个蜡，每个大于2小时。小时。冰冻切片：固定后脱水用冰冻切片：固定后脱水用10%20%30%蔗糖（蔗糖（0.1MPBS溶）每个室温下溶）每个室温下4小时小时过夜，过夜，OCT包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组织，切面朝下，再用包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组织，切面朝下，再用OCT将组织没过，尽量将组织没过，尽量减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明时取出，放于减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明时取出，放于-80C保存。保存。9切片切片石蜡：冷水石蜡：冷水温水（温水（54-56） 烤片（烤片（80） 切好烤片后可以室温保存。切好烤片后可以室温

6、保存。冰冻：切片温度冰冻：切片温度-18-20 直接贴直接贴 切好于冰冻丙酮中固定切好于冰冻丙酮中固定5分后分后-20 保存。保存。10固定方法注意事项固定方法注意事项1.组织块大小组织块大小2cmx2cmx0.5cm2.组织标本应及时放入固定液中组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸切忌干涸3.组织固定后必须冲洗组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液除去多余的固定液4.一般固定剂温度以室温一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温某些病毒则须低温 下处理下处理,用丙酮用丙酮-20度至度至-40度固定度固定30分钟分钟5.浓度采用浓度采用10%中性甲醛或中性甲醛或4%多聚甲醛多聚甲醛6. 固定液量是标

7、本体积固定液量是标本体积20倍倍7.固定时间不超过固定时间不超过24小时小时11组化实验设计组化实验设计1.对常规组织切片进行仔细观察对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供形态学特点根据可提供形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标本选择最佳并能反映病变的组织标本2.列出免疫组化的指标列出免疫组化的指标3.进行预实验进行预实验(设立阳性、阴性对照设立阳性、阴性对照)4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育温度及孵育时间找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育温度及孵育时间5.每张切片应表明抗体名称每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆防止相互混淆1213实验过程实验过程70考片一夜考片一夜二甲苯二甲

8、苯3个每个个每个10分钟无水乙醇，分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个每个10分钟分钟3%双氧水阻断室温双氧水阻断室温10分钟（现配现用）分钟（现配现用）抗体修复液（现配，抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒）一次一个抗体盒） 微波炉高火微波炉高火6-7分分冷却至室温冷却至室温再修复一次冷却再修复一次冷却PBS5分分3擦片加一抗，擦片加一抗，4过夜过夜14第二日第二日PBS5分分3加二抗加二抗 室温室温20分分PBS5分分3DAB显色显色水冲水冲5-10分分苏木素苏木素1-3分分水冲水冲10-15分分80%85%90%每个每个3分分95%（2个）无水乙醇（个）无水乙醇（2个）

9、二甲苯（个）二甲苯（2个）每个个）每个5分分中性树胶封片。中性树胶封片。15免疫荧光免疫荧光PBS5分分35%BSA室温封闭室温封闭1小时小时加一抗，加一抗，4过夜或根据说明书时间过夜或根据说明书时间第二日第二日PBS5分分3加二抗加二抗37孵育孵育1小时小时PBS5分分3DAPI染色染色PBS2分分丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。16HE70烤片一夜烤片一夜二甲苯二甲苯3个每个个每个10分钟无水乙醇，分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个每个5分钟分钟苏木素苏木素1-5分分水水盐酸酒精盐酸酒精水水0.5%氨水氨水17水水95%酒精酒精2分分0.5%醇

10、溶伊红醇溶伊红1秒秒95%酒精酒精30秒秒95%酒精，无水乙醇（酒精，无水乙醇（3个）每个个）每个2分分二甲苯（二甲苯（2个）每个个）每个2分钟分钟中性树胶封片，吹干中性树胶封片，吹干18病理相关试剂配制病理相关试剂配制4%多聚甲醛：多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末溶于多聚甲醛粉末溶于500ml水（水（50左右）黄枪头加一滴左右）黄枪头加一滴1M氢氧化钠至氢氧化钠至澄清，冷却至室温，与澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS混合，滤纸过滤。混合，滤纸过滤。0.2MPB:1000ml 0.2M磷酸氢二钠磷酸氢二钠810ml称称57.996g 0.2M磷酸二氢钠磷酸二氢钠190ml称称5.928g蔗糖：用蔗糖：用0.1MPBS配制配制生理盐水：生理盐水：0.85%氯化钠溶液氯化钠溶液19阻断液：阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配）修复液：（修复液：（400ml） 柠檬酸柠檬酸0.16g 柠檬酸钠柠檬酸钠1.18g苏木素：苏木素：100g硫酸铝钾加热溶于硫酸铝钾加热溶于1250