ELISA试验设计

1、PRRSV灌白抗体检测间接ELISA方法的建立1材料：1.1蛋白、血活、酶标二抗原核表达PRRSV N蛋白；标准阳性血清和阴性血清，待检血清；自制HRP标记兔抗猪IgG;1.2主要试剂和溶液包被液（50 mmol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液）Na2CO31.59 gNaHCO32.93 g准确称取后，溶于 950 mL的蒸储水中，调 pH值为9.6,定容到1 L;PBS-T 洗涤液 1000 mL 10 mmol/L pH7.4 的 PBS 中加入 0.5 mL Tween-20 ;封闭液和血清稀释液含10%小牛血清的PBS-T缓冲液，10%马血清的PBS-T缓冲液，含5%BSA的PBS-T

2、缓冲液，含10%BSA的PBS-T缓冲液，含5%脱脂奶的PBS-T缓冲液；底物溶液 100 mmol/L的柠檬酸溶液（21 g柠檬酸C&H6O7?H2。溶于去离子水，定容 至 1 L） 24.3 mL, 200 mmol/L Na 2HPO4?12H2。（71.6 g Na2HPO4?12H2。溶于去离子水，定 容至1 L）25.7 mL混匀，加入50 mg的四甲基联苯胺（TMB ），临用前加入50此的30% H2O2；终止液（2 mol/L H2SO4）每200 mL终止液，由蒸储水 177.8 mL和浓硫酸 22.2 mL混和而成。1.3主要仪器设备电热恒温培养箱；4C冰箱；酶标仪

3、。2步骤：2.1抗原包被浓度和二抗稀释度的确定将原核表达的 N蛋白分别作 2.0昭/mL , 1.0四/mL , 0.5四/mL , 0.25昭/mL, 0.1g/mL0.05 g/mL连续稀释6个稀释度，每个稀释度重复两孔，100（±/孔，4C包被酶标反应板过夜。将自制 HRP标记的兔抗猪二抗分别做1:50、1:100、1:200和1:400 一系列倍比稀释，每个稀释度重复两孔，100此/孔，组成方阵确定重组蛋白的最佳包被浓度和二抗稀释度。封闭1 h后，每个稀释度重复两孔，100 L孔，各步37C反应30 min，显色5min后终止。 在酶标仪测定各孔 OD450nm值。先取阳性

4、OD450nm值在1左右的，然后再从中找出阳性血清 OD450nm值和阴性血清 OD450nm值之比（即P/N ）最高的反应孔的抗原浓度和二抗稀释度为最 佳抗原包被浓度和二抗稀释度。NP/N1:100PNP/N1:200PNP/N1:400PNP/N2.2缺失肽包被条件的确定以最佳抗原浓度包被酶标板。以 37 C包被2 h加4 C过夜；4C过夜和37 C包被2 h四 种条件包被酶标板，其余条件不变进行间接ELISA。以P/N值最大且阳性OD 450nm值接近于1.0的孔对应的包被条件为最佳的抗原包被条件。阴性 OD 450nmP/N2.3血活稀释度的确定以最适抗原浓度和最佳包被条件包被酶标板，

5、并以HRP标记山羊抗猪二抗最佳稀释度进行间接ELISA，将已知的阳性血清和阴性血清作1:25、1:50、1:100、1:200和1:400连续几个稀释度稀释，其余条件不变进行间接ELISA。1:251:501:1001:2001:400表3 N蛋白最佳血清稀释度的确立血清稀释度OD 450nm封闭披或血清稀释液或血清稀释液10%小牛血清10%马血清5%BSA10%BSA5%脱脂奶阳性血清OD 450nm阳性血清OD 450nm阴性血清OD 450nm阴性血清OD 450nmP/NP/NOD 450nm阳性 OD 450nm阴性 OD 450nmP/N2.4封闭液及血活稀释液的确定以最适的抗原浓

6、度和最佳包被条件包被酶标板，洗涤后，加入不同的封闭液。 第一组用10%小牛血清进行封闭；第二组：用 10%马血清进行封闭；第三组：用 5% BSA进行封闭； 第四组：用10% BSA进行封闭；第五组：用 5%脱脂奶进行封闭。37C封闭2 h,其余条件 不变进行间接ELISA，以P/N值最高者为最佳封闭液及血清稀释液。表4 N蛋白封闭液和血清稀释液的确定5%脱表5 N蛋白最佳封闭时间的确立封闭时间OD450nm37 C 60 min37 C 90 min37 C 120 min37C 30 min封闭时间37C 30 min37 C 60 min37 C 90 min37 C 120 minOD

7、450nm阳性 OD450nm2.5封闭时间的确定以最适的抗原浓度和最佳包被条件包被酶标板，洗涤后，加入确定的最佳封闭液脂奶，以37C不同封闭时间，其余条件不变进行ELISA，确定合适的封闭时间。以 P/N值最高者为最佳封闭时间。阴性 OD450nmP/N2.6血活反应时间的确定在已经优化的反应条件基础上，加入标准阴阳性血清进行反应，按作用的时间分为组，第一组：37C作用30 min;第二组：37C作用60 min ;第三组：37C作用90 min；第 四组37C作用120 min。再经过酶标抗体 37C作用30 min后加入底物溶液显色，终止反应，测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性

8、血清的P/N值，以确定待检血清反应的最佳时间。表格同表格5。2.7酶标二抗反应时间的确定在已经优化的反应条件的基础上， 加入标准血清进行反应， 然后加入酶标二抗， 按酶标 二抗的作用时间分为 4组，37C作用30 min ;第二组：37C作用60 min ;第三组：37 C作 用90 min ;第四组37C作用120 min。经洗涤，加入底物显色，终止反应，测定各孔的OD450nm 值，计算出各组阴阳性血清的 P/N值，以确定待酶标二抗反应的最佳时间。表格同表格5。2.8底物反应时间的确定在已经优化的反应的条件基础上， 加入标准血清进行反应，然后加入酶标二抗，作用后 加入底物显色，按底物的作用

9、时间分成5组，37C作用10 min ;第二组：37C作用15 min；第三组：37C作用20 min；第四组37C作用25 min ;第五组37C作用30 min。经洗涤，加 入底物显色，终止反应，测定各孔的 OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的 P/N值，以确定 底物反应的最佳时间。反应时间OD 450nm反应时间OD 450nm表6 N蛋白底物反应时间的确立10 min 15 min 20 min 25 min 25 min 30 min阳性 OD450nm阴性 OD450nmP/N2.9阴阳性临界值的确定用N蛋白包被酶标板，按照已建立的间接ELISA方法，检测20份经IDEXX N

10、蛋白抗体检测试剂盒检测为 PRRSV N蛋白抗体阴性和经 RT-PCR检测为PRRSV病毒核酸阴性的 血清样本，每份血清重复 2孔，进行ELISA测定，结果见表9。表7N蛋白阴阳性临界值的确定OD450nm均值重复1重复2血清编号1234567891011121314151617181920经计算20份血清样本的 OD450nm值平均值和标准差。根据统计学原则，当样本的 OD450nm值大于阴性样本 OD450nm值平均值+ 3标准差（SD）时，可以在 99.9%水平上 判定为阳性。2.10交义反应试验按照已经确立的间接 ELISA操作程序，分别用引起猪繁殖障的五种主要疫病一一猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病、猪乙型脑炎的阳性血清进行间接ELISA的检测，检测这5种疫病的阳性血清与纯化的原核表达N蛋白有无交叉反应。用PRRSV BJ-4、HB-1/3.9和JXwn06人工感染猪的阳性血清进行PRRSV Nsp2抗体的间接ELISA检测，并计算原核表达 N蛋白与不同PRRSV毒株感染血清的交叉反应率。2.11.重复性试验取4块不同批次包被的酶标板， 检测已知阳性血清