SDS-PAGE电泳标准操作流程

1、SDS-PAG由泳标准操作规程1、目的建立SDS-PAG®泳的标准操作规程，确保电泳操作有序进行，保 证电泳的安全性、有效性。2. 范围与职责适用SDS-PAG由泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施 负责，QA检查员、生产主管负责监督。3. 程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽 中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧， 下端紧贴密封条。3.1.2分离胶的配置3.1.2.1 10% 分离胶配方如下表:10%交蒸馆水30%Acr-Bis(29:1)1.5MTris-Hcl PH8.810%SDS10%AP（过硫酸铉）TE

2、MED5 ml1.3 ml1.7 ml1.9 ml0.05 ml0.05 ml0.007ml3.1.2.2 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm）。在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气， 使胶 面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的 胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5% 浓缩胶配方下表:5%胶蒸馆水30%Acr-Bis(29:1)0.5MTris-HclPH 6.810%SDSJ 10%AP(过硫酸铉)TEMED2 ml1

3、.4ml0.33 ml0.25ml0.02ml0.02ml0.02ml3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内 （分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。 约30分钟，聚合完全。3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴 橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘 与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入 1X tris-gly 电泳缓 冲液。3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 U的样品，依次加上20 M 5x buffer（

4、加了 B-筑基乙醇），混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （ 加了 B-筑基乙醇）煮沸10分钟。3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液 10 v l ,小心地依次加入到各凝 胶凹形样品槽内，marker加入到其中一个槽内，为区别两块板， marker可加在不同的孔槽中。3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待漠酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再 把浓缩胶刮掉，取下。3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿

5、中，染液漫过胶即可，置于摇床 上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用 水洗掉染液。3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净， 条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也 可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。4. 注意事项4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。 一般为100KD-50KD选用 10%交；50KD-30KCB用 12嗾；30KD-10K涎用 15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头 或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻 璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时 更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过 长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEM