真核基因组DNA的克隆策略和方法

1、真核基因组dna的克隆cdna的克隆化技术的成熟，很多染色体的mrna互补的序列己弄清楚，为丰富人体遗传 信息库做出了贡献。除此以外，真核细胞染色体dna消化后的片段，合适的载体进行克隆, 也是得到目的基因的重要方法。染色体dna序列大部分含有插入序列，即内含子(intron).内 含子的数量不等。而cdna则仅代表了外显子(exon)的序列。大肠杆菌等原核细胞不能识 别真核细胞染色体dna的内含子，因此其表达研究，仅对应用cdna,而不能应用真核基 因组带冇内含了的dna。棊因治疗中的冃的基因，既町选择cdna,也町选择染色体dnao一、染色体dna克隆的载体构建染色体dna文库并进行克降的

2、载体有两大类：入噬菌体载体和粘粒载体。质粒载体其 容量有限，而染色体dna由于带有内含子序列而较长；单链丝状噬菌体载体仅用于克隆单 链dna,因此质粒载体和单链丝状噬菌体载体都不适用干染色体dna的克隆。由于粘粒可接纳近45kb的外源dna,几乎是入噬菌体载体载最的2倍，因此，在一个哺乳 动物基因组dna文库中，仅需350000个重组粘粒，则可望某一特定的单拷贝序列存在于 其中的概率达99%。然而，在粘粒中构建和贮存文库要比在入噬菌体中更困难得多，因而 只有当靶基因过大，而不能为单个入噬菌休所包容，或者耍分离一系列跨过染色体dna特 大区段的重叠克隆时，才采用粘粒。染色体dna克隆最为常用的载

3、体还是入噬菌体载体。以入噬菌体为基础构建的载体尽管已是分离众多真核cdna及基因组dna的有力工具，但 它们也只能接纳人小在一定范围内的插入片段。许多基因由于过于庞人，而不能作为单一片 段克隆于这些载体之中，如人凝血因子讯基因长达180kb,肌营养不良基因至少长isookb, 因此需要建立容量更大的克隆载体。酵母人工染色体(yac)方法的建立，使克itdna大区段的工作至少冇了可循z经。使川 yac载体进行克隆时，基因组dna须在剪切力较小的条件下从实验组织中小心制备，以便 得到平均数白万碱基对人小的片段。随后应用一限制酶(如ecord部分消化dna,以产生 平均大小为200 500kb的大片

4、段，这些片段再连接到经过适当处理以防止自身环化的yac 载体两臂上。除eoori以外，也可用noil和mlul 一类切点稀少的限制酶进行完全消化。二、从哺乳动物细胞中分离高分子量dna哺乳功物dna的分离通常是在有edta和sds 一类的去污剂存在！、一 1!1蛋口酶k,消化 细胞，随后用酚抽提而实现的。低分子量的朵质以透析法加以去除。这一方法获得的dna, 其大小为1()0 15()kb.适用于以入噬菌体载体构建基因组dna文库。然而，若耍用粘粒 建立棊因组dna文库，贝ij要求用更大的dnao三、染色体dna文库的建立不论dna的碱基组成及序列，而以真正随机的方式将dna打断成片段的唯-方

5、法就是机 械剪切。但山此方法制备的染色体dn段的末端，并非用于克隆的粘性末端，需要进一步处 理。包括末端的修复、甲基化、与接头连接并以合适的内切酶进行消化以便产生合适的粘性 末端。经过机械剪切或限制性内切酶的消化，产生的片段长度也不一致，必须通过密度梯度离心纯 化，才能得到所需的大小的片段。按照dna克隆化中程序的方法，将入噬菌体载体用合适的限制性内切酶消化，然后再与处 理过的染色体dna在t4dna连接酶的作用下进行连接，进行大规模地包装反应，并建立 预期大小的基因组dna文库。基因组dna文库建立以后，还必须对此文库进行扩增。四、染色体dna文库的筛选一染色体dna文库的筛选主要是应用so

6、uthern杂交分析方法等。1. 将对疑阳性克隆，快速小量法提取dna,以同位素或地高辛等标记的探针进行杂交，显 影或显色分析。2. 入噬菌体噬菌斑的原位杂交先将入噬菌体的噬菌斑在硝酸纤维素膜上或尼龙膜上进行固 定，入噬菌体噬菌斑也可以原位进行扩增后再固定.然后对入噬菌体分离物进行快速分离快速分析.3. dna序列分析克隆的dn段，最后以dna序列分析，加以证实。快速克隆真核生物基因，h前都是通过功能基因组或是同源序列法。选用功能基因组的方法，需要构建好 的cdna文库,然后利用合适的探针进行筛选。如果你有构建好的差异农达的文库，就更方便了。通过这 种方法可以获得人量的候选基因，但是后续的转基

7、因验证工作，工作量相当大。如果选用同源序列法，只 能克隆在其他物种中已经克隆的慕因。将这些在其他物种中已经克隆，但在昆虫中未见报道的基因的序列找到，利用已知的昆虫基因组序列与z比较。利用两者的同源保守区段设计引物，将昆虫中的这一基因扩 增出来。得到片断以后,再将整个基因拿到。0前基因克隆化中比较常用的载体一以及由这些载体改建和衍生的多种类型。可以根据各种载体的特点以及克隆基 因的特点进行选择。根据载体和目的基因片段末端的性质，在质垃载体屮进行克隆可采取不同的策 略。如杲载体和目的基因以同一种内切酶切割，或两种片段都是平端，那么可以 在dna连接酶的作用下直接克隆。如果切割载体和0的基因的酶是不

8、同的三种 酶或四种酶，那么可产生不匹配的末端，那么这种情况下可应用大肠杆菌dna 聚合酶i或其klenow片段进行补平或消平，形成平端后连接。质粒载体和目的基因进行重组连接以后，就可以转化感受态的大肠杆菌宿主细 胞。形成含有重组质粒的菌落，然后利用小规模制备质粒dna进行限制酶切分 折，q互补现象的检查法，重要标记基因的失活以及菌落原位杂交等方法进行筛 选、.鉴定。以得到口的基因在质粒载体小的克隆。入噬菌体载体从噬菌体颗粒屮分离到的入dna是线状的双链分子。dna分子很大，冇48502 个碱基组成，但对它的生活史，遗传特征，dna全部核昔酸序列等进行了详细 研究。这种线状双链分子，两个亍端都有

9、12个碱基长的单链，并且序列互补， 称之为c()s位点。野生型入dna内有许多限制性内切酶位点，木身不适宜作为 基因克隆化的载体。但通过缺失，置换和突变的方法可以减少侮一个限制性酶切 点的数量.以便于基因克隆化的操作。野生型入噬菌体dna中虽然含有在基因克隆中很有用的限制性内切酶的一些位 点，但这些位点大部分处于基因组中噬菌体生长，裂解所必需的区域，因而这些 酶切点乃至整个入噬菌体是不宜于做载体的。但它的另一个特点可供利用。即在 基因j和基因n之间，有厂段长约20kb的区域，除了 int,xis等基因与溶源过程 的重组作用冇关以外，都是非必需区域。实验发现，如果把一定长度的dna从 这个区域去

10、掉，或者加进一定长度的dna,只耍保持其原长度的75 105%z 间，就可以形成正常的噬菌斑。人们利用缺失、重组技术，将其改造成了一系列 的克隆载.体.包括。haron-4a> charonzia>。haron32 一 35 和。haron4o 系歹ll, e:mbl3、embl4 和 embl3a 系列,入 2001,入 dash 和入 fix 系列，a gtlo,入 gtll,枯 tls 23,入 orfs 和入zap载体等。入噬菌体dna作为载体与口的基因dna重组以后，用提取的包装物体外进行 包装，感染宿主菌，以入噬菌体噬斑的原位杂交以及入噬菌体分离物的快速分析, 筛选和鉴

11、定克隆化的基因。粘粒载体枯粒载体，又叫科斯质粒载体(cosmidvectcr),由质粒载体与入噬菌体载体的cos 区域进行构建的，由于其结构屮含有嘴菌体载体的cos粘性末端而得名，主要是 为了克隆较长的真核dn段来构建的。粘粒载体的主要组成部分：抗药性.标记 基因，质粒复制的起始位点，一种或多种限制性内切酶单一切点，入噬菌体的 cos末端。它可克隆的目的基因长度达4kb。经过构建粘粒载体与入噬菌体体外 包装系统结合使用，它是一种很好的克隆载体，其优点：能容纳较长的外源dn 段，其长度可达29 4skb,可以进行体外包装，形成具有感染性的类噬菌体颗 粒,：感染率很高，进入宿主细胞以后，粘粒象普通

12、质粒一样进行复制。可用提 取质粒的方式对粘粒进行捉取。根据粘粒载体结构屮的抗药性基因，很容易选择 出转化细胞。目前用于在细菌中增殖真核dna的粘粒载体包括pjbs,czrb,pcaflembl等， 用于转染哺乳动物细胞的枯拉载体包括phc,2'o.,k,pcv,pcv,"pcvu,8,ptm,pmcs,pnnl,ph%',cosz02,coszopwe,5,pwe<< 以及克隆粘粒载体9等系列。粘粒载体常用于真核染色体dna文库的构建和扩增，染色体dna的克隆等。 单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体一般都是由m13单链噬菌体衍生而来的。m13是一种纤维状的

13、大肠杆菌噬菌体，它有一个蛋口质外壳和一条环状的单链dnao该噬菌体仅能 吸附到含冇f因子的大肠杆菌上，通过性纤毛把其dna注入细菌屮，并与单链 dna结合蛋口相结合。m13噬菌体dna长度为6407个核昔酸，其中冇一个507个核昔酸序列为非必 需区域，在该区域内加进外源dna不会影响噬菌体的增殖，只是使纤维状的噬 菌体变得更长一些而己。据此构建了一系列单链噬菌体载体，包描m13mp,及 m13mp,9 等.m13单链噬菌体载体的特点是：重组噬菌斑的筛选方法和pvc质粒系列完全一 祥，是通过颜色变化来识别的；能够克隆单链dna,以便直接用于dna序列分 析，并有简便、快速、经济等优点；插入片段长

14、度不能超过1。o个核昔酸， 否则在单链噬菌体增殖过程屮外源dn段易形成缺失，一般来说，300 - 400个 核昔酸的外源基因序列在此类载体中是十分稳定的。载体的选择可用于基因克隆化的载体有许多种，但主要的是质粒载体，粘粒载体，入噬菌体 载体和单链丝状噬菌体载体这四大类。这些载体，各有其特点，但其功能不可互 相代替，因此须根据情况进行选择，也可以此为基础，根据需要重新构建.如近 年來重新构建的一种叫做噬菌体质粒的载体（pha罗m记），就是单链噬菌体与 质粒有关的dna结构重组而成，其构成类似粘粒载体，这样就扩充了载体的功 能。克隆载体的选择至少应根据外源dn段及载体性质来考虑，还要注意其操作流程 的简易性以及是否经济等因素。枯粒和各种入噬菌体质粒可接纳大片段的dna, 使它们成为构建和扩增真核基因组dna文库的良好工具，但对于小片段來说， 则不利于其dna的详细分析和操作，因而是较为粗陋的载体。就目前所设计的 资料来看，不适用于。dna文库的构建。单链噬菌体