研究生创新基金资助项目申请书

1、研究生创新基金资助项目申请书项目类别：优秀博士学位论文培育 创业种子项目名称 叶酸缺乏导致心血管系统发育异常的机制研究 申请人姓名孙淑娜所在院系复旦大学儿科医院填表h期2004年4刀23 fi复旦大学研究生院一、基本情况姓名孙淑娜学号041107210院系复旦大学儿科医院专业儿科学专业层次博士导师桂永浩电话（办）54237092电话（家子信箱 041107210fudan. edu. c n题目叶酸缺乏导致心血管系统发育界常的机制研究申请资助金额（元）3万元预计完成时间 2007年2月31日二、近期已取得的与本项目有关的主要研究成果（含论文、专著、专利等）1. shu

2、na sun, yuexiang wang, tao zhong, houyan song, yonghao gui. malformation of zebrafish cardiovascular system caused by inhibiting the function of folic acid.投稿于 2006 .6 于美国举行的"the 7th international meeting on zebrafish development & genetics",并 已被大会接收。此文章近日投稿sci收录期刊：development dynamics

3、2. 孙淑娜，桂永浩叶酸描抗剂mtx t扰斑马鱼胚胎发育及外源性fthfa的描抗作用药学学报（已 投稿）3. 孙淑娜，桂永浩叶酸生物学活性受抑制后下调斑马仇mef2a、mef2c的表达（已完成）4. “叶酸拮抗剂mtx对斑马鱼心血管系统发冇影响的实验研究”一一第二届江浙沪儿科学会议优秀论 文奖5. “叶酸缺乏对斑马鱼心血管系统发育影响的实验研究” 一一2005年度复旦大学儿科医院论文比赛一 等奖三、项目论证1 对项目的论证：基本内容、重点和难点、国内外研究现状分析、本项目的理论意义和实践意义，并附 列主要参考文献及出处；2.对项目实施和完成条件的论证：研究生的研究水平和时间保证、资料设备、 科

4、研手段；3.研究方案的论证；4.对市场产业化前景的论证（仅对“创业种子资助项目”）。1. 对项目的论证：基本内容和重点:木研究从叶酸缺乏导致先天性心脏病的机制探讨入手，用化学遗传学和基因阻抑 两种手段构建叶酸缺乏斑马鱼生物模型，观察叶酸缺乏导致斑马鱼心血管发育异常的表型，并以此为平 台，开展后续叶酸缺乏对斑马鱼心脏发育相关基因表达影响的研究。同吋对儿童体内叶酸僅物学作用发 挥的关键解基因（泅 基因）突变与先天性心脏病发病之间的关系进行了初步探讨。从实验室研究和 临床研究两方面入手探寻叶酸缺乏导致先心病的机理。国内外研究现状分析：先天性心脏病（chd）是严重危害儿童生命和健康的疾病，发病率为81

5、0%活产婴儿。在其致病 的诸多因素小，环境因素中维生素的缺乏不容忽视。近年来，人群中大量的流行病学调查结果显示人类 叶酸缺乏可导致许多先天性界常的发生率明显上升，如：先天性心脏病、神经管发育缺陷、颌面部畸形 等异常5且母亲孕期适当补充叶酸可以有效的预防这些先大性畸形的发牛。以这些调查研究的结果 为依据，利用模式生物开展叶酸缺乏导致先天性心脏病发病机制的研究目前已成为国内外热点。目前人 鼠中构建的叶酸缺乏模型主要冇两种方法，一是将与叶酸生物学作用发挥冇关的基因剔除，造成叶酸缺乏的模式，二是利用公认的叶酸牯抗剂阻断叶酸生物学作用的发挥。叶酸在进入体内后发挥生物学作用时，有赖于其向细胞内运输或代谢中

6、许多因子的共同作用，如叶 酸受体（fr）、还原叶酸载体（rfc）、二氢叶酸还原猶（dhfr） 5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶（mthfr） 等。1=1前在人群中开展的基因多态性研究及利用动物模型实验都已发现上述一些因了相关基因的功能紊 乱可导致叶酸正常生物学作川的发挥受抑制，继而发牛先心病等先犬性发育异常。但冃前对其确切 的机理仍不明确。人类的旳a%基因定位于5q33染色体，对于心脏、咽弓和肢体发育有重要作用，其对于心肌询体 细胞的分化和心肌分化吋细胞的定位十分关键叫在人类心肌病中发现有旳*z少基因的表达下调向。 hand2对人类ufd1l基因的表达有调节作用，刃莎"基因又与人类2

7、2qll缺失综合征有很大关系。另 外，/加与人类dgs的发病也相关。/加还通过和其他心脏特异性转录因了，如gata4. nkx2. 5、 mef2a、盟ef2c、tbx5、tbx1、end-l、tbx2o、/w等的相互作用来调节心脏的发育。在斑马鱼中， hand2突变可导致心脏发育明显缺陷w 叶酸缺乏是否干扰了上述心脏发育关键因子的功能而导致先天 性心脏病的发生尚未有明确的结论。斑马鱼是今年來新兴的一种模式牛物，其心血管系统透明、便于观察，且繁殖量大、发育周期短， 是心脏发育生物学研究的理想动物模型。在国内外其它利用叶酸缺乏动物模型进行的研究中，叶酸缺乏 小鼠z和叶酸牛物学活性受阻小鼠说、有胚

8、胎多系统的发育障碍，胚胎未发育至成熟即死亡；而斑马 鱼的胚胎在发育严重界常吋仍能依赖周围水环境小的氧气存活一段吋间，这就避免了由于胚胎死亡而导 致的实验观察的终止，我们利用斑马鱼这一特点，开展叶酸缺乏研究。本研究的理论意义和现实意义：在近年国内外流行病学调查研究中发现人群中各种原因导致的叶酸缺乏与先心病发生率升高冇关。 国外学者有报道，母亲长期或在孕期服用dhfr抑制剂（氨甲蝶吟、乙胺咳噪、氨苯蝶咙及甲氧莘妁可 以导致后代发生先天性心脏病等界常何。本研究以此为切入点，通过阻断dhfr的功能构建斑马鱼叶酸 缺乏模型，并探讨叶酸缺乏后对心脏发育相关基因功能上的影响，以探寻叶酸缺乏导致先心病的机制，

9、 有重耍的理论和现实意义。2. 对项目实施和完成条件的论证：本课题组申请人所在单位是复旦大学儿科医院，我院配有国内领先水平的实验仪器和较高的实验技 术。木课题将与复旦大学分了医学教育部重点实验室协作完成，该实验室冇符合国际标准的斑马鱼实验 室，并有成熟的实验技术和配备齐全的实验设备，可以保证木课题的顺利完成。在木课题已进行的6个 月吋间内，我们已熟悉了斑马血的饲养和繁殖技术、斑马血的发育规律，并对基因探针的制备、原位朵 交的操作等关键技术有较完全的掌握，有利于开展后续的研究。3. 研究方案的论证：木课题挑选目前备受关注的先心病致病环境因素为研究点之一，应用新兴模式生物斑马鱼开展叶酸 缺乏导致先

10、心病的基因水平机理研究，有完整的理论基础和周密的实验设计。显微注射吗啡咻修饰的反 义核昔酸是-种新兴的能够特界下调基因表达的技术（，在斑马鱼小此技术操作相对简便，有利于开 展基因水平的研究；且斑马血是化学遗传学研究的理想研究生物模型口“°在构建斑马鱼叶酸缺乏模型 时，针对/仰分别采用化学遗传学方法和棊因阻抑方法阻断叶酸生物学活性的发挥，在探讨叶酸缺乏 后对心血管发冇相关基因功能的干扰时，同时采用原位杂交和real-time pcr的方法论证。在前阶段 实验中，我们已用化学遗传学方法在近2. 5万枚胚胎中成功筛选出心血管发育界常表型，探寻到观察心 血管系统发育干扰的mtx最适宜处理吋段

11、和浓度；并发现叶酸纶物学活性受抑制后心血管发育相关棊因 hand2、mef2a、mef2c、flk-1的表达不同程度卜调。以此我们选择围绕旳切幺进行后续实验，在阐明 hand2表达阻抑和过表达时对必产勿、必7少g tbx1、tbx5、ph0x2a、gata4、twist1等心脏发育相关 因子表达的基因网络调控后，我们加入叶酸干扰因素，探讨上述因子表达的差界，从而初步探索叶酸导 致先心病发生的机理。在临床部分研究屮，仍以dhfr为切入点，探讨其基因突变与先心病的关联性； 有利于指导临床诊断，有十分重要的临床意义，并为前部分的实验研究提供更充足的理论依据。(详见下表)(参考文献)1 .mcdona

12、ld sd, ferguson s, tam l, et al. the prevention of congenital anomalies with periconceptional folic acid supplementation. j obstet gynaecol can. 2003 feb;25(2):115-21.2. botto ld, mulinare j, erickson jd. do multivitamin or folic acid supplements reduce the risk for congenital heart defects? evidenc

13、e and gaps. am j med genet a. 2003 aug 30; 121 (2):95-101.3. pci lj, ren ag, hao l, ct al. study on the association between reduced folate carrier gene polymorphism and congenital heart defects and cleft lip with or without cleft palate. zhonghua liu xing bing xue za zhi. 2004 dec;25( 12): 1063-7.4.

14、 li d, pickell l, liu y,et al. maternal methylenetetrahydrofolate reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice. am j clin nutr. 2005 jul;82(l): 188-95.5. hand2 regulates epithelial formation during myocardial diferentiation.tr

15、inh le a, yelon d, stainier dy curr biol. 2005 mar 8; 15(5):441-6.6. hand1 and hand2 are expressed in the adult-rodent heart and are modulated during cardiac hypertrophy.thattaliyath bd, livi cb, steinhelper me, toney gm, firulli ab.biochem biophys res commun. 2002 oct 4;297(4):870-5.7. absence of m

16、utations in human ubiquitin fusion-degradation protein gene in tetralogy of fallot.chung my, lu jh, weng yy, hwang b j mol med. 2001 jun;79(5-6):338-42.8. the zebrafish van gogh mutation disrupts tbxl, which is involved in the digeorge deletion syndrome in humans.piotrowski t, ahn dg, schilling tf d

17、evelopment. 2003 oct; 130(20):5043-52.9. cooperative activation of atrial naturetic peptide promoter by dhand and mef2c.zang mx, li y, xue lx, j cell biochcm. 2004 dec 15;93(6): 1255-66.10. the bhlh transcription factor hand2 plays parallel roles in zebrafish heart and pectoral fin development.yelon

18、 d, ticho b, halpern me, development. 2000 jun; 127( 12):2573-82.11. kimmel c b, ballard w w, kimmel s r, et al.stages of embryonic development of the zebrafish.dev dyn,1995,203:253-31012. maternal methylenetetrahydrofolate reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive out

19、comes and congenital heart defects in mice. li d. pickell l. liu y. wu q. cohn js. rozen r.american journal of clinical nutrition. 82(1):188-95, 2005 jul.13 . mice lacking the folic acid-binding protein folbp 1 are defective in early embryonic developmen匸 jorge a. piedrahita, betty oetama, gregory d

20、.l 999 nature america inc.14. hernandez-diaz s, weiler mm, walker am,et al. folic acid antagonists during pregnancy and the risk of birth defects. n engl j med. 2000 nov 30;343(22): 1608-14.15. nasevicius a, ekker sc.effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. nat genet. 2000 oct;26(2)

21、:216-2016. zebrafish as a novel experimental model for developmental toxicology.congenit anom (kyoto). teraoka h, dong w, hiraga t.2003 jun;43(2): 123-32.（附表：实验设计方案）一、实验研究部分斑马鱼叶酸缺 乏模式的构建z采用化学遗传学方法，在胚胎受 精后6-10h用叶酸拮抗剂mtx（抑制叶酸发挥纶物学活性通 路中关键酶dhfk的活性）处理 胚胎采用dhfr基因表达阻抑方法， 在胚胎受梢后单细胞期显微注 射吗啡i林修饰的反义rna观察心脏发育异

22、常表型，并通过原位杂交和real-timepcr的方法检测胚胎整体及心脏中心血管发育相关基因hand2、mef2a、阴ef2c、7场7及胡s2整体表达水平的差前期实验结果已表明叶酸生物学活性受抑制后，对斑马鱼心血管发育产生干 扰，hhand2、mef2a、mef2c、甩的表达不同程度的下调挑选hand2基因进行深入探讨叶酸缺乏对hand2及其靶基因表达的影响:阐明hand2基因表达阻抑和使其过表达后，部分心脏发育相关基因在时相和 空间上的表达变化探讨hand2基因表达阻抑并给予叶酸与 只hand2基因表达阻抑这两种情况f, 心脏发育的表烈变化及心血管发育相关 基因在时相和空间上的表达变化探讨h

23、and2基因过表达的同时阻抑dhfr 表达与只iiand2基因过表达这两种情况 下，心脏发冇的表型变化及心血管发冇 相关基因在吋相和空间上的表达变化二、临床研究部分采集临床先心病患儿血标 木，并按先心病种类分组采集与先心病患儿匹配的正 常对照组患儿血标本抽提dna,经pcr扩增dhfr基因全 长序列后进行对比寻找先心病患儿及正常対照组患儿dhfr基因序列上的差界，并探讨此差界与 先心病发牛的关系，从临床角度捉供dhfr基因异常而导致的叶酸生物学活性 受抑与先天性心脏病的发生有关，进一步为上述的实验室研究部分提供理论依 据四.预期研究成果研究阶段（起止时间）阶段成果名称成果形式2005.9-20

24、05. 10通过化学遗传学的方法观察叶酸拈抗剂mtx对斑马 鱼心血管发育的影响及外源性fthfa的拮抗作用， 筛选出适合后续分子生物学实验的合适处理吋段及 浓度权威期刊文章2篇2005. 11-2006.5探讨 hand2、mef2a、mef2c、tbx1、has2 及 flk-1 等心血管发育相关基因在正常斑马也屮的时空表达 规律及应用叶酸拮抗剂后其基因表达水平的变化12006. 6-2006.8明确用下调 泅基因的方法阻断叶酸生物学活性发 挥后，hand2、mef2a、mef2c、tbx1、has2 反 flk-1 等心血管发冇相关基因表达水平的变化sct文章1篇2006. 9-2006. 11阐明卜调hand2基因和使其过表达后，部分心脏发育 相关基因在时相和空间上的表达变化权威期刊1篇2006. 12-2007. 1探讨在下调hand2基因并给予叶