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文档简介
1、如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的 问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下 ,于大家分享。载体主要有 病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素#复制起始位点 Oril即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。#抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如 Amp+l ,Kan+#多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段l# P/E启动子/增强子l# Termsl 终止信号#加poly (A)信号
2、l可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1 ) Ampr水解B 内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2 ) tetr可以阻止 四环素进入细胞。(3 ) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物 ,使之失去毒性。(4 ) neor ( kanr )氨基糖苷磷酸转移酶 使G418 (卡那霉素衍生物)失活(5 ) hygr使潮霉素B失活。第三步:看多克隆位点(MCS )。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果 在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛
3、选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源DNA片段。一 般来说,外源 DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有 表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号#启动子-促进 DNA转录的DNA顺序,这个 DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游, 是DNA分子上可以与 RNApol特异性结合并使之开始转录
4、的部位,但启动子本身不被转录。#增强子/沉默子为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程 的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子一负增强子,负调控序列。#核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs ): mRNA有核糖体的两个结合位点, 对于原核而言是 AUG (起始密码)和 SD序列。l#转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的 保守序列,此位点 down stream 有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly (A)加尾 信号。回答有人之前提
5、出的一个问题: 为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针? 那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA ,它的启动子等在其中一条链上,而它 的抗性基因在另一条链上 .三、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写)1. 什么是载体即要把一个有用的基因 (目的基因 研究或应用基因) 通过基因工程手段送到生物细胞 (受体 细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体( vector )。P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类按功能分成:(1 )克隆载体都有一个松弛的
6、 复制子 ,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克 隆和扩增 DNA 片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严 谨型载体)(2 )表达载体具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs 等)还具有转录 / 翻译所必需的 DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分:( 1)原核载体 (2 )真核载体( 3)穿梭载体( sbuttle vector ) 指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间) . P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。3. 基因工程载体的 3 个特点:(一)都能独立
7、自主的复制:载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如 MCS , 插在其中的外源 DNA 片段,能被动的跟着载体一起复制 / 扩增,就像载体的正常成分一样。(二)都能便利的加以检测:如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因, 将受体细胞放在含 有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。(三)都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。4. 载体的选择和制备:选择载体主要 依据构建的目的 ,同时要考虑载体中 应有合适的限制酶切 位点 。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点:【1
8、】构建 DNA 重组体的目的,克隆扩增 / 表达,选择合适的克隆载体 /表达载体。【2 】.载体的类型:( 1 )克隆载体的克隆能力据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。( 2 )表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭, E.coli/ 哺乳类细胞表达载体。( 3 )对原核表达载体应该注意 3 点: 选择合适的启动子及相应的受体菌;用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位; 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3 】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接, 不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点
9、要求: 选分子量小的质粒,即小载体(1 - 1.5kb )-不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体); 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; 必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr (试一试)。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。质粒载体质粒(plasmid )是细菌或细胞染色质以外的,能自主复制的,与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下: 是染色质外的双链共价闭合环形 DNA (cov
10、alently closed circuar DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300kb 之间,v 15kb的小质粒比较容易分离纯化,15kb的大质粒则不易提取。 能自主复制,是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。一般质粒 DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类:严紧控制(stri nge ntcon trol )型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联,拷贝数较少,每个细胞中只有1个到十几个拷贝;另一类是松弛控制( relaxedcontrol )型质粒,其复制宿主不偶联,每个细胞中有几十到几百个拷贝。每
11、个质粒DNA上都有复制的起点,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制,不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制,称为附加体,例如细菌的性质粒就是一种附加体,它可以质粒形式存在,也 能整合入细菌的 DNA,又能从细菌染色质 DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两 个细菌间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation ),通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。 质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体,线粒体DNA也是环状双链分子,也有独立复制的调控,但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线
12、粒体是细胞的一部分,质粒也往 往有其表型,其表现不是宿主生存所必需的,但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因 功能有利于宿主细胞的特定条件下生存,例如,细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因,女口 编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因,这种质粒称为抗药性质粒, 又称R质粒,带有 R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是 寄生的,而是共生的。答学生问:克隆载体与表达载体FROM红泥小火炉问题:基因工程中有克隆载体和表达载体, 克隆载体可以在受体菌中大量复制, 表达载体用于 表达目的蛋白, 那么实际应用中, 我们的最终目的是要得到目的蛋白, 克隆载体不能完成表
13、 达,有何用呢?还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后, 再将其转移到表达载体中 实现表达?它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能?构建兼有克隆和表达双重功能的载 体有何困难? 回答:1. 克隆的目的比较单一,就是将你感兴趣的 DNA 片段,重组进入载体,然后于宿主细胞中 大量繁殖, 主要用于各种文库的建立, 比如人类基因组计划; 同时由于载体所能容纳的目的 片段的长度是有限的, 而克隆载体没有表达所需的各种片段, 所以可以容纳更长的目的片段, 即可以克隆足够长的基因,效率更高。2. 重组 DNA 需要使用限制性内切酶,因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点,现在 的 T/A 克隆载体可以
14、直接克隆 PCR 产物,省去了两端加装识别位点的设计, PCR 效率就更3. 表达载体的目的是多样化的,为了实现实际工作中的需要,不同的目的就要设计不同的载 体,用表达载体克隆基因不是不可以,实际工作中要考虑更多,因此更复杂。4. 细菌摄取能量的能力是一定的,如果用来合成大量蛋白质,合成核酸就会少。5. 细菌承受的工作负荷也是有限的,给它的工作太多,效率必然低下,这和我们日常生活是 一个道理。原因很简单,不是不能,是完全可以,但是效率会低很多。所以我们一般的策略是,将目的 片段克隆于非常简单的克隆载体上,按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。 回答的不是很系统,如有问题可以继续来信讨
15、论,希望对你有所帮助。新浪网友 2009-10-10 08:48:28 举报 您好!您博文里得 “T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物,省去了两端加装识别位点的设计, PCR 效率就更高。 ”是什么意思?我是初学者,请求赐教。博主回复: 2009-10-16 09:51:51T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了 T,而Taq酶有在PCR产物后随机加 A的特 性,所以PCR产物直接可以接入 T载体。而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后 接入载体,所以在设计 PCR 引物时两端要加酶的识别位点,而加装的序列与模板不配对, 因此 PCR 效率会低很多。新浪网友 2010-01-08 13:00:09 举报 老师,您好! 您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因,而现在多用 PCR 就可以达到这个目 的。那这个目的基因的主要用途是什么?只用来测序吗? 表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧?盼望您的回复!谢谢博主回复: 2010-03
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