如何阅读质粒图谱(更新版本)

1、如何阅读质粒图谱最近由于实验需要，需要查阅载体图谱，到园子里搜罗一番，发现虽然有人问载体图谱阅读的 问题,也有前辈回答，但都不详细，借自己也在琢磨这个问题的机会，将我学到的东西整理一下 ，于大家分享。载体主要有 病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素#复制起始位点 Oril即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。#抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+#多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段l# P/E启动子/增强子l# Termsl 终止信号#加poly (A)信号

2、l可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。(1 ) Ampr水解B 内酰胺环，解除氨苄的毒性。(2 ) tetr可以阻止 四环素进入细胞。(3 ) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物 ，使之失去毒性。(4 ) neor ( kanr )氨基糖苷磷酸转移酶 使G418 (卡那霉素衍生物)失活(5 ) hygr使潮霉素B失活。第三步：看多克隆位点(MCS )。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果 在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛

3、选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源DNA片段。一 般来说，外源 DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有 表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号#启动子-促进 DNA转录的DNA顺序，这个 DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游， 是DNA分子上可以与 RNApol特异性结合并使之开始转录

4、的部位，但启动子本身不被转录。#增强子/沉默子为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程 的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子一负增强子，负调控序列。#核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs )： mRNA有核糖体的两个结合位点， 对于原核而言是 AUG (起始密码)和 SD序列。l#转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的 保守序列，此位点 down stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly (A)加尾 信号。回答有人之前提

5、出的一个问题： 为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针？ 那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA ，它的启动子等在其中一条链上，而它 的抗性基因在另一条链上 .三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）1. 什么是载体即要把一个有用的基因 （目的基因 研究或应用基因） 通过基因工程手段送到生物细胞 （受体 细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（ vector ）。P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类按功能分成：（1 ）克隆载体都有一个松弛的

6、 复制子 ，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克 隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严 谨型载体）（2 ）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录 / 翻译所必需的 DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分：（ 1）原核载体 （2 ）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间） . P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。3. 基因工程载体的 3 个特点：（一）都能独立

7、自主的复制：载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如 MCS ， 插在其中的外源 DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制 / 扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因， 将受体细胞放在含 有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。4. 载体的选择和制备：选择载体主要 依据构建的目的 ，同时要考虑载体中 应有合适的限制酶切 位点 。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点：【1

8、】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增 / 表达，选择合适的克隆载体 /表达载体。【2 】.载体的类型：（ 1 ）克隆载体的克隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（ 2 ）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭， E.coli/ 哺乳类细胞表达载体。（ 3 ）对原核表达载体应该注意 3 点： 选择合适的启动子及相应的受体菌；用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位； 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3 】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接， 不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点

9、要求： 选分子量小的质粒，即小载体(1 - 1.5kb )-不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)； 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一试)。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。质粒载体质粒(plasmid )是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： 是染色质外的双链共价闭合环形 DNA (cov

10、alently closed circuar DNA,cccDNA)，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb 之间，v 15kb的小质粒比较容易分离纯化，15kb的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。一般质粒 DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制(stri nge ntcon trol )型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制( relaxedcontrol )型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每

11、个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，也 能整合入细菌的 DNA，又能从细菌染色质 DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两 个细菌间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation )，通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。 质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线

12、粒体是细胞的一部分，质粒也往 往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因 功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，女口 编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒， 又称R质粒，带有 R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是 寄生的，而是共生的。答学生问：克隆载体与表达载体FROM红泥小火炉问题：基因工程中有克隆载体和表达载体， 克隆载体可以在受体菌中大量复制， 表达载体用于 表达目的蛋白， 那么实际应用中， 我们的最终目的是要得到目的蛋白， 克隆载体不能完成表

13、 达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后， 再将其转移到表达载体中 实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载 体有何困难？ 回答：1. 克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的 DNA 片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中 大量繁殖， 主要用于各种文库的建立， 比如人类基因组计划； 同时由于载体所能容纳的目的 片段的长度是有限的， 而克隆载体没有表达所需的各种片段， 所以可以容纳更长的目的片段， 即可以克隆足够长的基因，效率更高。2. 重组 DNA 需要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在 的 T/A 克隆载体可以

14、直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计， PCR 效率就更3. 表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载 体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。4. 细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。5. 细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是 一个道理。原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。所以我们一般的策略是，将目的 片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。 回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨

15、论，希望对你有所帮助。新浪网友 2009-10-10 08:48:28 举报 您好！您博文里得 “T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计， PCR 效率就更高。 ”是什么意思？我是初学者，请求赐教。博主回复： 2009-10-16 09:51:51T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了 T,而Taq酶有在PCR产物后随机加 A的特 性，所以PCR产物直接可以接入 T载体。而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后 接入载体，所以在设计 PCR 引物时两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对， 因此 PCR 效率会低很多。新浪网友 2010-01-08 13:00:09 举报 老师，您好！ 您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用 PCR 就可以达到这个目 的。那这个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？ 表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧？盼望您的回复！谢谢博主回复： 2010-03