基于转录组分析的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞调控寄主的分子机制研究

1、基于转录组分析的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞调控寄主的分子机制研究1菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的发育和形态菜蛾盘绒茧蜂寄生寄主小菜蛾36h后,其胚胎两端的浆膜层开始解离形成畸形细胞，并在寄生48h后寄生蜂卵孵化时扩 散到寄主血淋巴中。寄生2d后解剖,每头寄生后的小菜蛾获得畸形细胞 94± 7 个，寄生5d后到达最大值144± 13个，此后开始下降直至幼蜂在寄主体内发育结 束；初产生的细胞直径15.05 ± 0.73卩m,并持续增大,至寄生后7d后到达最大值 57.49 ± 5.38gm,寄生8d后略有减小；光学显微镜和扫描电镜的观察结果显示畸 形细胞在不同的发育时期均

2、为近球形 ,体积不断增大 ,微绒毛分布规那么且密度持 续增大。离体培养时，寄生2d后每个寄生蜂胚胎产生畸形细胞 96 ± 8个,寄生6d后达 到最大值151 土 10个并维持这一水平直至寄生8d后；初产生的畸形细胞直径 16.14 ± 0.98卩m,并在发育过程中维持这一水平；光学显微镜和扫描电镜的观察 结果显示离体培养的畸形细胞初产生时近球形 , 发育过程中形状逐渐变得不规那么 , 体积增长趋势不明显 , 细胞外表微绒毛较为稀疏 , 分布杂乱。 2 菜蛾盘绒茧蜂畸形 细胞的转录组测定和分析菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的转录组测序共产生总碱基数 为 1,254,124,980 的

3、6,967,361 条 reads >233,765 个 con tig >38,706 个 scaffold 和 24,165 个 unigene。分别对 contig 、scaffold 和 unigene 长度的分布进行分析发现绝大多数序 列长度小于400bp。Nr注释结果显示共有63.5%的unigene 15,340个比对上 数据库中的 15,043 个基因。可注释序列中79%勺比对结果E值介于1.0E-50到1.0E-5之间；相似度的分析发现 44%的序列与比对上序列的相似度介于 60%-80%之间；比照对上的 序列 47%来自于黑腹果蝇、西方蜜蜂、冈比亚按蚊和丽蝇蛹集

4、金小蜂。根据基因 注释的结果，畸形细胞转录组测序所得序列鉴定得到以下类群功能基因：寄生 蜂幼虫营养摄取的相关基因 , 主要包括 trehalase 、matrixmetalloproteinase14 fatty acid binding protein 和hexamerin等；对寄主生理调控的相关基因, 如 gamma-glutamyl cyclotransferase-like venomprotein 、juvenile hormone esterase 、 teratocytes secreted protein14 、venomprotein8 、endochitinase 和cys

5、teine-rich/pacifastinvenomprotein 等；抑制寄主免疫的相关基因,主要包括 venom protein Vn4.6 、venom protein Vn50、C-type lectin 等； 毒素基因 , 主要包括 venom allergen5 和 venom acid phosphatase A2; 抗菌肽 基因,包括defin sin等；微绒毛组装的相关基因,主要包括 ezrin-radixin-moesin 、 supervillin 和 fambrin 等。3菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的数字基因表达谱测序1、 3、 5日龄畸形细胞(teratocytes-1d

6、、 teratocytes-3d 和 teratocytes-5d )的数字基因表达谱测 序分别得到 5,895,449 、 6,272,972 和 6,214,769 条 reads, 比对上转录组中的序 列数分别为 14,504、 11,772 和 13,917 个。相关性分析发现 teratocytes-1d 和 teratocytes-5d 相关性最小。GO注释结果显示，比对结果为cell killing 、protein tag 的基因只在3日 龄畸形细胞中表达 , 比对结果为 nutrient reservoir activity的基因只在 3 日龄和 5 日龄畸形细胞中表达 ,

7、比对上其他功能类别的基因在不同发育时期的表达 较为类似。功能基因表达模式研究发现 , 寄生蜂幼虫营养摄取相关基因中trehalase 前期表达量很高 , 并随着细胞的发育逐渐降低； matrix metalloproteinase14 根本在细胞发育后期表达 ,fatty acid binding protein那么细胞发育早期表达量较高 , 并逐渐降低； hexamerin 基因随细胞发育表达量逐 渐增加。涉及对寄主发育调控的 6 类基因有 3 种表达模式 ,juvenile hormone esterase 和 teratocytes secreted protein14 在细胞发育前期有

8、较高的表达 , 其他发育阶段表达量较低； venomprotein8 和 cysteine-rich/pacifastin venom protein 只在细胞发育末期表达； gamma-glutamyl cyclotransferase-like venomprotein 和 endochitinase 在细胞发育不同时期表达水平相差不多。抑制 寄主免疫相关基因、抗菌肽和毒素基因主要在细胞发育后期表达。涉及微绒毛组装的基因细胞发育前期和中期表达水平较高, 后期有所降低。4寄生蜂幼虫营养摄取相关基因的克隆和表达用qPCF对unigene19276(trehalase )、unigene5800

9、(matrix metalloproteinase14)、unigene20417( fatty acid binding protein)和 unigene10893(hexamerin )的表达模式进行验证, 发现 unigene19276 主要在前期( 2 日龄畸形细胞) 表达, 而 unigene5800 那么主要在后期( 5日龄畸形细胞)表达 ,unigene10893 的表达量呈逐渐缓慢增加 的趋势,unigene20417在发育早期(1-4日龄畸形细胞)发育过程中表达较为稳 定, 后期( 5日龄畸形细胞)略有降低 , 。克隆得到unigene5800的全长cDNA序列,命名为MM

10、P-14基因序列全长2,052bp,1,791bp的开放阅读框编码一个 66.35kD的蛋白；N末端有一个信号锚 序列；氨基酸序列上分布有 3 个保守功能域 , 依次为PG_binding₁s,ZnMc_MMF和 HX 构建表达载 体pET-28-MMP-14并原核表达得到一个大于70kD的蛋白。5调控寄主发育相关 基因的克隆和表达用qPCR对unigene4760 (gamma-glutamylcyclotransferase-like venom prote

11、in)、unigene14814(juvenile hormoneesterase )、 unigene17429 (teratocytes secreted protein14 )、unigene20419( venom protein8 )、unigene20917(endochitinase )和 unigene18359( cysteine-rich/pacifastin venom protein)的表达模式进行验证。Unigene4760在4、5日龄时表达量显著高于 1、2日龄；unigene14814和 unigene17429在1日龄时的表达量均显著高于其它时期 ，unigen

12、e17429在4日龄 时也有一个表达顶峰；unigene20419、unigene20917 和 unigene18359 在 5 日龄 时的表达量显著高于其它时期。对unigene4760和unigene17429进行克隆,得到 两个全长分别为665bp和585bp的基因序列,命名为TSVP-GGC和TSP-13oTSVP-GGC包含一个558bp的开放阅读框，编码分子量21.37kD的蛋白；无 信号肽；含有一个 GGCT like功能域；构建表达载体 pET-2S-TSVP-GGC并原核 表达得到一个26kD左右的蛋白，制备的多克隆抗体可以与菜蛾盘绒茧蜂毒液蛋 白发生免疫反响。TSP-13

13、基因342bp的开放读码框编码一个12.9kD的蛋白质， 有信号肽序列,无保守功能域,构建表达载体pET-32-TSP-13但没有表达出相应 的蛋白。6抑制寄主免疫相关基因的克隆和表达 qPCR对unigene20211(venom protein Vn4.6)、unigene23309( venomprotein Vn50)和 unigene20211( C-type lectin )的基因表达模式进行验证发现主要在细胞发育后期表达。克隆得到 unigene20211、unigene23309、unigene23761 等 3个基因的 cDNA全长序列,分 别命名为 TSVP-8 TSVP-

14、42和 TSVP-SEPTSVP-8的cDNA全长为454bp,含有一个216bp的开放读码框,编码分子量为 7.97kD的蛋白质；有信号肽序列；无保守功能域。TSVP-42的cDNA全长为1314bp, 含有一个1143bp的开放读码框,编码分子量为41.94kD的蛋白质；无信号肽序列； 包含一个 Tryp_SPc 保守功能域。TSVP-SEP勺cDNA全长为1389bp,含有一个1116bp的开放读码框,编码分子 量为40.68kD的蛋白质，有信号肽序列，包含一个Trypvsub>S</sub>Pc保守功能 域。构建表达载体pET32-TSVP-8和pET28-TSVP-42分别表达出一个小于26kD 和大于43kD的蛋白质，pET28-TSVP-SEP那么未表达出相应的蛋白质。重组蛋白制备多克隆抗体可以与菜蛾盘绒茧蜂的毒液蛋白发生免疫反响。 进 一步研究发现TSVP-8原核表达蛋白可以抑制寄主血淋巴的黑化。7毒素基因的克隆和表达用 qPCR对unigene8816 (venom allergen5 )和 unigene19070 (venomacid phosphatas