汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定

1、汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴宦汉坦病毒是引起肾综合征出血热(hfrs)的主耍病毒，汉坦病毒的基因由l、m、s三 个片段构成，分别编码病毒rna聚合酶，囊膜核蛋白g1和g2及核衣売蛋白(简称核蛋 口，nucleocapsid protein, np)。血清学研究表明，汉坦病毒核蛋口具有很强的抗原性和免疫 原性，同吋xp抗原可以少汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应，表明汉坦 病毒的np具有共同的抗原决定族。有鉴于此，我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化，并 用sds-page和western-blotting对重纽核蛋白进行鉴定，为其应川于诊断抗原捉供技术依 据。1材料与方

2、法1. 1质粒与菌种汉坦病毒76-118株由木室保存，表达质粒pgex-4t-l,菌株bl21从上海申友公司购买。1.2单克隆抗体和血清单克降抗体由北京病毒所杭长寿教授和安徽医科大学倪大石教授惠赠；病人血清由上海 市南汇区传染病医院提供。13引物的设计与合成上游：gac cag gaa ttc gcc cat gag got caa tta g : 下游：tct gaa ctc gag gat gat gct cag cca gtc t。其pcr产物长度为334 bp,产物上游酶切位点为ecori;下游酶切位 点为xhoe1.4模板制备从htnv 76 -118株感染的vero-e6细胞中提取

3、总rna作为模板。用引物扩增出汉坦病毒 s片段核心区域334 bp的片段，通过pcr反应获得目的片段，反应步骤如f：每10 d引物溶于200 ul水中，模板1r 1pl溶于10 ul水中，加样：模板1 u l, 10x buffer 5 u l, mg 2c1 (25mm) 3 u l, 4dntp (10 mm) 1 u l, primer-up 1 u l, primer-downl ul, taq (5 u/ul)0.5 p l,加水至 50 u lo 反应条件：94°c 2 min ； 94°c 30 s,65°c30 s, 72°c 40 s,

4、 35 个循环；72°c5 min。1.5重组质粒的构建分别用限制性内切酶ecori, xhol酶切上述扩增片段和质粒pgex-4t-1,以低熔点琼脂糖 电泳回收1=1的片段，然后进行连接反应。用连接产物转化感受态宿主菌e. coli bl21,挑取转 化菌，提取质粒，用酶切法和pcr扩增法鉴定重组质粒。1. 6. 1将质粒(目的基因、空载体)转入bl21 (de3)菌株中取出冻存的bl21 (200 u l/tube) 冰屮溶解，取5 ul连接液加入菌液中，轻轻混匀，冰浴30 min, 42°c 1.5 min,冰浴2 min, 加入 500 m l lb 37°

5、;c 100 rpm45 min,取 200 » l 涂布至 amp 板(100 y g/nil), 37°c倒置培 养过夜，至克隆长出；扩增：収单克降至3 ml amp/lb中37°c 250 rpm过夜；质粒抽 提；测序。1.6.2少量表达取以卜-菌株在amp培养基2xyt»p摇菌过夜(目的基因、空载体、bl21空 菌（无抗性）共4管，各取50 pls夜菌加入5 ml 2xyt培养基中，其中目的基因接两管,379 250 rpm3 h,加入iptg至终浓度0. 5 mmol,37°c 250 rpm4 h,诱导。胡一管1=1的基因继续 再诱

6、导1 h,其余取出，每管取出100 pl菌液，离心后沉淀待用，目的基因（二管），收集余下 的4.9 ml菌体，悬于500 ul pbs中，超声波裂解（12 s/次，共3次），鬲速离心后分别 保留沉淀与上清。1. 6. 3大量表达取少量甘油菌,在20 ml amp/2xyt培养基中摇菌过夜。取出10 ml过夜 菌转入1l培养棊中，250 rpm 37°c摇2. 53 h至0d600为0. 40. 6,加入iptg至终浓度0. 5 mmol,继续摇菌3. 54 h。收集菌体，按1 £湿菌体/lomlbuffer a悬浮细菌，合 并成两管，超声10 min, 5 000 rpm

7、10 min ,弃上清。沉淀用buffer 20 ml悬浮（可用 超声悬浮）保证充分悬浮，再超声10个10 s ,离心后弃上清。重复1次。沉淀用buffer b 悬浮，室温放置20 min,离心12 000 rpm , 15 min,重复2次。用buffer c 20 ml溶解沉 淀过夜。15 000 rpm, 15 min离心。取上清，对buffer d透析，每次大于8 h ,至少2次, 再对buffer a透析，每次大于8 h，至少3次。1. 6.4表达产物的鉴定sds-page电泳分析及考马斯亮蓝染色,western-blot进行表达产 物的鉴定。2结果2. 1sds-page蛋白电泳及

8、考马斯亮蓝染色鉴定重组表达的蛋白实验表明，该蛋白已表达,并存在于菌体的包涵体屮，重组表达的蛋白为167込约12 000, gst的蛋白分子量为26 000,重组的融合蛋白总分子量为38 000。在沉淀蛋白泳带相对分子质量38 000的位置，明显 可见一条新生蛋白条带，与预计相对分子质量相符，可初步确定其为插入基因的表达产物（图 l）o2. 2用western blotting检测重组蛋白将重组汉坦病毒蛋白分別与hfrs单克降抗体及hfrs患者血清进行免疫印迹法反应，结 果表明，重组汉坦病毒蛋白能与hfrs单克隆抗体及iifrs患者血清特界性结合（图2）。3讨论肾综合征出血热应采用早发现、早诊断

9、、早治疗的治疗方案，患者血清中抗核蛋白抗体 出现早。汉坦病毒的s基因在汉坦病毒中高度保守，是体液免疫的主要识别抗原，能刺激机体 产牛人量的抗体，同时参与细胞介导的保护性免疫，其编码产物核衣売蛋白（np）是mrs诊断 的理想抗原¹0木研究对s棊因的部分片段进行了融合表达，克服了用感染的鼠肺或组织培养物制备的 天然抗原需严格的防护条件，产最有限，稳定性欠佳等多种不利因素²o近 儿年來已有较多研制重组抗原的报道。本研究采用了汉坦病毒s基因n端部分基因（12kd） 表达产物，而耒用全长s基因是由于s基因

10、表达产物为线性抗原，其抗原决定族主耍集中于 n端,而26kd抗原分子量小,表达量相对高,更适于抗原的制备³o我们把 n端部分s基因克隆于pgex-4t-l的ecorl, xhol酶切位点，与gst进行融合表达，融合蛋口质 （gst-np）的分子量为38kdo菌体的sds-page电泳表明融合蛋白gst-np为不可溶性表达，即 以包涵体的形式存在,western blotting染色表明表达产物冇抗原性。实验表明，选用gst 表达系统的特点是利川融合蛋口谷胱日肽转硫酶既町捉高表达和外源蛋口的町溶性，也可捉 供相对简易的检测和纯化方法⁴ohfrsv抗体的检测已有数种成熟的方法,但抗原的检测尚无令人满意的方法，其主要问 题是敏感性和特界性有待提高⁵o本研究中所采用的s基因片段为核心区域, 该片段足以产生流行于我国的两型汉坦病戢间的交叉免疫反应<sup> 6 </su