瓦氏黄颡鱼Pelteobagrusvachelli脂肪代谢相关基因cDNA的克隆及表达分析

1、yiT论女第表站家瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachel)脂肪代谢相关基因cDNA的克隆及表达分析【摘要】：随着水生动物营养学研究的不断深入和完善，近年来,鱼类的 脂类营养已逐渐成为营养学的一个研究热点。迄今不同学者分别从脂类营养与动物的生长性能、生理学参数，以及生化酶和代谢之间的关系等方面做了大量的工作，但从分子水平上，尤其是有关外源营养素与 鱼类代谢相关酶基因之间关系的研究仍颇为缺乏。本论文以瓦氏黄颡鱼(darkbarbelcatfish,Pelteobagrusvachelli为研究对象,主要从分子角度 探讨了脂肪种类、水平等对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长和脂肪代谢的影响，研究结果可以

2、为完善瓦氏黄颡鱼人工饲料配方和全价配合饲料的开 发提供参考。本论文利用分子生物学技术和生物信息学方法，首先克隆了瓦氏黄颡鱼的主要脂肪代谢相关基因肝脂酶(hepaticlipase,HL),脂肪酸结 合蛋白(fattyacidbindingprotein,FABP),脂肪酸 合成酶 (fattyacidsy nthase,FAS) 和 肉 碱 酰 基 转 运 酶 (carnitineacetyltransferase,CAT)的 cDNA 片段，分析了 这些基因 的 cDNA序列和分子特征，以及在不同组织中的表达模式。在此基础上， 进行了室内饲养试验，研究了饲料脂肪种类和水平等对瓦氏黄颡鱼生 长

3、参数、脂肪代谢相关基因 mRNA表达的影响，探讨了它们在机体脂 肪的分解、转运，以及体内合成等过程发挥的作用。论文的主要结果 和结论如下：1瓦氏黄颡鱼脂肪代谢相关基因的研究本研究根据GenBnak中提供的生物学信息设计简并引物采用RT-PCR和克隆测序及生物信息学方法、从瓦氏黄颡鱼肝脏中克隆得到肝脂酶，肝型脂肪酸结合蛋白，心型脂肪酸结合蛋白，脂肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶 基因的CDNA片段。肝脂酶是血液循环中内源性甘油三酯代谢的关键 酶之一。本试验克隆了瓦氏黄颡鱼肝脂酶的部分cDNA序列。该片段长为1065bp序列，软件分析获得了 343个氨基酸，其序列与斑马鱼 (Daniorerio)、日本

4、鳗鲡(Anguillajaponica)、鳜鱼(Sinipercachuatsi) 斜 带石斑鱼(Epinepheluscoioides)真鲷(Pagrusmajor的肝脂酶具有很高 的同源性，分别为73%、68%、67%、66%和65%。经分析，所得瓦氏 黄颡鱼肝脂酶氨基酸残基中含有1个糖基化位点，催化中心三联体位点1个和多肽盖”等主要的结构功能位点，因而该基因属于脂酶家族。 定量PCR分析表明肝脂酶只在肝脏组织中表达，表明瓦氏黄颡鱼肝脂 酶的表达具有组织特异性，肝脏是分泌肝脂酶及其行使功能的主要场 所。脂肪酸结合蛋白是一类分子量较小，而对脂肪酸有高亲和力的可 溶性蛋白质。本试验采用简并引物

5、扩增获得了瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合 蛋白部分cDNA序列。肝型脂肪酸结合蛋白cDNA片段长为335bp, 软件分析获得111个氨基酸残基，与鲤鱼(Cyprinuscarpio)的肝型脂肪 酸结合蛋白的氨基酸序列同源性最咼，可达到90%。瓦氏黄颡鱼心型 脂肪酸结合蛋白cDNA序列片段长为425bp序列，包括26bp3端非编 码区。软件分析后获得114个氨基酸残基，与斜齿鳊(Rutilusrutilus)的 心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列同源性高达85%。结果表明克隆所得基因序列均属于脂肪酸结合蛋白家族。定量PCR分析表明,瓦氏黄颡鱼肝型脂肪酸结合蛋白在肝脏、 腹腔脂肪、肌肉和心脏组织有较高的表达量。心

6、型脂肪酸结合蛋白主要在肝脏、脂肪组织和心脏中表达，表明肝脏和腹腔脂肪组织均是肝型和心型脂肪酸结合蛋白表达的主 要场所。脂肪酸合成酶能催化机体内脂肪酸的从头合成住成内源性脂肪酸。本试验采用RT-PCR技术成功分离了瓦氏黄颡鱼脂肪酸合成 酶cDNA序列片段，序列长为674bp,软件分析后获得216个氨基酸残 基与斑马鱼（D.rerio）脂肪酸合成酶氨基酸序列同源性最高（87%）,其次 是红原鸡 （Gallusgallus,79%）、 南方短尾负鼠 （Monodelphisdomestica,70%）褐家鼠（Rattusnorvegicus,68%等。定量 PCR分析表明，瓦氏黄颡鱼脂肪酸合成酶 m

7、RNA在肝脏、肠道、腹腔 脂肪、心脏组织的表达水平显著高于肌肉等组织（P0.05）,脂肪酸合成酶mRNA的表达量上升，有利于促进脂肪酸的生物合成，以满足不同组 织细胞分化增殖对脂质营养和能量的需要。肉碱酰基转运酶属于转运酶家族，能转运从乙酰辅酶A到L-肉碱等酰基基团。本试验获得了瓦 氏黄颡鱼肉碱酰基转运酶部分 cDNA序列，片段长为494bp,序列软件 分析后获得156个氨基酸残基，与斑马鱼（D.rerio）和红原鸡（Ggallus）的 肉碱酰基转运酶氨基酸序列同源性分别为81%和70%,分析表明所得序列属于酰基转运酶家族。PCR检测发现瓦氏黄颡鱼肉碱酰基转运酶 主要在肝脏、腹腔脂肪组织和肌肉

8、等组织中表达，提示这些组织均为能量代谢的重要场所。瓦氏黄颡鱼肝脂酶、心型脂肪酸结合蛋白、脂 肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶 cDNA片段的成功克隆，为研究瓦氏黄 颡鱼脂肪代谢提供了基础资料。根据肝脂酶、心型脂肪酸结合蛋白、 脂肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶的组织表达特点，后续的生长试验中,选择了鱼的肝脏和腹腔脂肪组织为目标靶器官，研究了饲料脂肪种类和水平对瓦氏黄颡鱼的生长和脂肪代谢的影响。2饲料脂肪种类对瓦 氏黄颡鱼的生长和脂肪代谢相关基因表达的影响研究了饲料中不同 脂肪种类对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、主要脂肪代谢相关基因表达的影 响。试验以鱼粉和豆粕为蛋白源，分别添加8%的全鱼油、豆油、猪油、 混合油1(

9、豆油和鱼油混合=3: 1)、混合油2(豆油和鱼油混合=1: 3), 配制了等氮等能的5种饲料。每组设三重复，投喂初始平均体重约为 1.0g的幼鱼80天。结果表明，鱼油、豆油、混合油1和混合油2饲料 4个处理组均表现出较好的生长趋势，终末体重和特定生长率分别达到 7.67g、7.47g、8.21g、8.31g 和 2.52%、2.50%、2.65%、2.63%,均 显著高于猪油组6.13g和2.32%(P0.05)。饲料脂肪源对瓦氏黄颡鱼的 腹腔脂肪率和肝体指数无显著影响，腹腔脂肪率分别为 3.52%,4.49%,3.70%,3.92%,4.42% ；肝体指数分别为 2.66%,2.88%,3.

10、06%,3.08%,2.54%根据所得的结果，可以认为短期内 以豆油作为脂肪源不会显著影响瓦氏黄颡鱼的生长。定量PCR分析主要脂肪代谢相关基因mRNA表达显示,在肝脏组织中，混合油2组的 脂蛋白脂酶，肝脂酶，肝型脂肪酸结合蛋白和肉碱酰基转运酶 mRNA表 达量均显著高于其它组(P0.05)。而猪油组能促进脂肪酸合成酶mRNA 表达上调，且显著高于其它组(P0.05)。同时，在腹腔脂肪组织中，脂蛋白 脂酶和肝型脂肪酸结合蛋白 mRNA表达具有组织特异性，各组间均无 显著差异。混合油1组脂肪酸合成酶表达显著高于鱼油组(P0.05),而 其它组间无显著差异。肉碱酰基转运酶mRNA的表达在混合油1和混

11、合油2组中表现为上调,且显著高于猪油组(P0.05)。混合油2组饲 料中多不饱和脂肪酸百分含量(46%)最高能促进肝脏脂蛋白脂酶、肝 脂酶、肝型脂肪酸结合蛋白和肉碱酰基转运酶mRNA的表达显著上调(P0.05),提高饲料多不饱和脂肪酸的利用率，从而促进了瓦氏黄颡鱼 幼鱼的生长。上述结果提示，不同的饲料脂肪种类主要通过调节瓦氏 黄颡鱼肝脏的脂蛋白脂酶和肝脂酶分解脂蛋白的能力，使得肝型脂肪 酸结合蛋白转运脂肪酸、脂肪酸的合成活动发生相应的变化，最终使机体生长和代谢所需的脂肪酸得到满足。3脂肪水平对瓦氏黄颡鱼幼 鱼的生长和脂肪代谢相关基因表达的影响探讨了饲料中不同脂肪水 平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长和主要

12、脂肪代谢相关基因表达的影响。以鱼粉和脱脂豆粕为饲料蛋白源，鱼油和大豆油等比例混合为脂肪源，分别 配制含有5%,11%和20%三个脂肪水平的等氮饲料。试验组每组各设 三个重复，投喂初始平均体重1.0g左右的幼鱼,70天后5%、11%和20% 处理组平均体重分别为8.45g、7.92g、6.94g。经统计分析,5%和 11% 处理组的终末体重、特定生长率显著高于20%处理组。从生长试验来 看,饲料脂肪水平对瓦氏黄颡鱼的生长有显著的影响，随着饲料脂肪水平增加，腹腔脂肪率显著升高(P0.05)分别是2.56%,4.27%和 6.06%；但 随饲料脂肪水平提高，鱼的肝体指数没有显著变化，分别为2.59%

13、； 2.47%和 2.58%。对主要脂肪代谢相关基因 mRNA的定量PCR分析 显示,随着饲料脂肪水平的升高，肝脏脂蛋白脂酶，肝脂酶和肝型脂肪 酸结合蛋白的mRNA表达水平显著提高(P0.05);而脂肪酸合成酶和 肉碱酰基转运酶的mRNA表达水平却显著下降(P0.05),肉碱酰基转运ww 论女第表匸凉酶mRNA表达在11%处理组和20%处理组之间无显著差异（P0.05）。 同时，在腹腔脂肪组织中，11%处理组脂蛋白脂酶基因 mRNA的表达量 显著低于20%处理组（P0.05）,略低于5%处理组。肝型脂肪酸结合蛋白 mRNA表达在11%处理组中最低，并显著低于5%处理组（P0.05）。肉碱 酰基

14、准转运酶mRNA表达在20%处理组最高，显著高于11%处理组和 5%处理组（P0.05）。此夕卜,5%处理组脂肪酸合成酶表达水平显著高于 11%处理组和20%处理组（P0.05）。上述研究结果表明，饲料脂肪水平会 影响肝脏和腹腔脂肪组织脂肪代谢相关基因mRNA的表达；过高的饲料脂肪水平，能通过增强肝脏和腹腔脂肪组织中的脂肪分解，促进脂 肪酸转运,抑制脂肪酸生成等环节来调节脂肪的代谢，以减少脂肪在机 体内组织器官的沉积。4瘦素对瓦氏黄颡鱼脂肪代谢相关基因表达的 影响本试验分析了腹腔注射小鼠瘦素重组蛋白对瓦氏黄颡鱼肝脏脂 肪代谢的影响。试验设置4个处理组，分别注射20卩g/100卩1,5卩g/10

15、0卩I, 磷酸缓冲液（PBS,100和未注射空白组（对照组），每个组含三个重复， 每个重复放养9尾试验鱼（体重30±0.5g）。对试验鱼隔天注射一次，连 续饲养15天，按常规饲养投喂和管理。试验结果表明，与未注射组的鱼 相比,注射不同含量的瘦素均能显著地提高鱼肝脏中肉碱酰基转运酶 mRNA的表达量（P0.05）,但不同注射剂量的各瘦素处理组间无显著性 差异。低瘦素浓度组能显著地促进肝型脂肪酸结合蛋白mRNA的表达（P0.05）但注射瘦素会显著抑制脂肪酸合成酶 mRNA的表达，且随注 射浓度的增加，其mRNA的表达随之明显下降（P0.05）。此外，瘦素注射 能增加脂蛋白脂酶和肝脂酶mR

16、NA的表达,但均与对照组无显著差异(P0.05)。结果提示外源瘦素可能是通过促进肝型脂肪酸结合蛋白 mRNA的表达，增加了体内脂肪酸的转运能力；同时，由于脂肪酸合成 酶mRNA表达水平的降低，抑制了体内脂肪酸的合成，从而促进机体脂 肪代谢活动，维持鱼体的脂肪贮存量和能量的平衡。【关键词】：瓦氏黄颡鱼饲料脂肪豆油脂蛋白脂酶肝脂酶脂肪酸结合蛋白脂肪酸合成 酶肉碱酰基转运酶瘦素【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：S917.4【目录】：摘要6-11Abstract11-16第一章文献综述16-39第一节鱼类 脂肪代谢的研究进展16-23第二节脂肪代谢相关基因的研究现状23-37第三节本论文研究的目的和意义 37-39第二章瓦氏黄颡鱼脂肪 代谢相关基因的研究39-80第一节瓦氏黄颡鱼HL基因cDNA序列的 克隆及分析39-52第二节瓦氏黄颡鱼FAS基因cDNA序列的克隆及 分析52-60第三节瓦氏黄颡鱼 FABP基因cDNA序列的克隆及分析 60-72第四节瓦氏黄颡鱼CAT基因cDNA序列的克隆及分析72-80第 三章饲料脂肪种类对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长和脂肪代谢相关基