人脐带静脉灌注液间充质干细胞分离及鉴定

1、人脐带静脉灌注液间充质干细胞分离及鉴作者：刘晓丹，刘兵，李秀森，毛宁【摘要】本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在 间充质干细胞及其分离和扩增方法。从正常产妇分娩后的脐 带静脉灌注液分离间充质干细胞，观察细胞形态并用流式细 胞仪分析其细胞表型和细胞周期，在体外分别诱导其成骨、 成脂肪和成软骨细胞分化。结果表明：脐带静脉灌注液来源 的间充质干细胞为成纤维细胞样，高表达cd29、hla abc、 cd166、cd105、cd73、cd44；不表达造血和内皮标志(cd34、 cd45、cd 144和cd14)。它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化, 符合间充质干细胞的基本功能特征。结论：人脐带静脉灌注

2、液存在间充质干细胞，能够在体外培养和扩增，可作为今后 细胞治疗和组织工程的种子细胞。【关键词】脐带静脉灌注液isolation and identification of mesenchymal stem cells from perfusion of human umbilical cord veinabstract this study was aimed to investigate whether mesenchymal stem cells (mscs) existed in human umbilical cord vein and to est ablish the met ho

3、ds of isolation and expansion in vitro. the mscs direved for perfusion of umbilical cord vein (uvmscs) were collected after parturition of healthy pregnant women. the morphology of mscs and their differentiation potential into osteoblast, adipocyte and chondrocyte were observed the phenotype and cel

4、l cycle of mscs were determined by using f 1 ow cytometry. the resuit showed that the mesenchymal stem cells separated from umbilical cord vein gave rise to a population of adherent cells with a typical fibroblast like morphology. similarly to bone marrow derived mscs, they highly expressed cd29, hl

5、a abc, cd166, cd105, cd73 and cd44, and were negative for any hematopoietic and endothelial markers (cd45, cd34, cd14 and cd144). functionally, they could differentiate into the osteoblast, adipocyte and chondrocyte it is concluded that mscs exist in the human umbilical cord vein perfusion. their re

6、ad amplification in vitro contribute to clinical applications for cell therapy and tissue engineering.key words mesenchymal stem cell； umbilical cord vein perfusion； cell isolation； cell identification间充质干细胞(mensenchymal stem cells, msc)最早 自骨髓中分离，是一类具有自我更新及多向分化潜能的中 胚层源干细胞：lo作为多种骨髓基质的前体细胞，msc能 通过调节造血

7、微环境以促进造血干细胞增殖、分化，它亦能 调节淋巴细胞免疫功能，从而减轻移植排斥反应等生物学效 应2o msc的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是 脐血移植中的干细胞数量相对不足及减轻移植物抗宿主病 提供了 一个有效手段3, 4。然而，临床上骨髓取材困难, 供体有限，随年龄的增加其增殖和分化能力下降，且有病毒 污染的可能5。因此，寻找msc的新来源具有重要意义。 本研究从易于获取、且组织来源较为原始的脐带静脉灌注液 中寻找msc (uvmsc),并对其进行生物学特性的鉴定。材料和方法材料与试剂脐带来自北京市中西医结合医院正常分娩产妇，均经父 母授权同意。iv 胶原酶为sigma公司产品，a

8、 dmem为 hyclone公司产品，胎牛血清为fbs, stem cell产品，l 谷氨酰胺为amresco公司产品，egf为peprotech公司产品， rh vegf为r&amp；d公司产品，bfgf为双鹭药业公司产品， 胰蛋白酶为amresco公司产品，诱导试剂：地塞米松、b 甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、3异丁酸1甲基黄11 票吟 (ibmx)，胰岛素、消炎痛、丙酮酸钠均为sigma公司产品，tgf b3为r&amp ； d公司产品，its a为sigma公司产品; 流式相关鼠抗人单克隆抗体:cd29 pe、cd166 pe、cd14、cd144 pe、 cd34 fi

9、tc、 cd45 fitc、 hla abc fitc、hla dr fitc、cd44 fitc、cd105 fitc 均为 becton dickinson公司产品)，碱性磷酸酶检测试剂盒为sigma公司 产品。中国实验血液学杂志j exp hematol 2007； 15(5)人脐 带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定uvmsc的分离培养 与传代取正常产妇分娩后的脐带静脉，无菌条件下用pbs清洗 脐带静脉外表面及脐带静脉，止血钳夹住一端，根据脐带静 脉的长度，加入适量的0. 1% iv型胶原酶，371孵育30分钟, 弃去脐带静脉内液体，用pbs灌注脐带静脉3次，收集灌注 液，按1 x10

10、5/cm2,接种于25 cm2的塑料培养瓶中，培养体系为：10%fbs、a mem、egf (long/ml). rh vegf (10 ng/ml),青霉素(100 u/ml )、链霉素(100 u/ml )、l 谷氨酰胺2 mmol/l,置于371和5% c02条件下孵育72小时后换新鲜培养液，待细胞融合达80%以上，加入0.05%胰 蛋白酶edta溶液消化，按1 ： 3或1 ： 4传代。待3代后， 细胞形态呈纤维细胞状，可停止加入egf和vegf。取3代以 上细胞作后续试验。uvmsc表面抗原的检测取第5代处于对数生长期uvmsc,按每管2x105个细胞, 依次加入10 口1鼠抗人单克隆

11、抗体cd29 pe、cd166 pe、 cd73 pe、cd14 pe、cd 144 pe、cd34 fitc、cd45 fitc、 hla abc、hla dr、cd44 fitc、cd105 fitc,另设 1 管 为对照组，室温避光30分钟；用pbs反复洗2-3次，减少 非特异性结合；离心后,加入1%多聚甲醛固定，4£保存，1 周以内进行流式细胞仪检测。uvmsc的细胞周期检测收集对数生长期uvmsc 1x106, pbs洗2次，0.9% fbs 的70%乙醇重悬,£c保存过夜，然后用pbs洗2次，加1 mg/ml rnase于37°c孵育30分钟，加入15

12、0 u g/ml pi,室温避光 20分钟，上流式细胞仪进行细胞周期检测。uvmsc的生长曲线检测收集uvmsc细胞，按每孔500个细胞接种于96孔板内， 每组3个复孔，待24小时后，加入mtt 20 ul, 4小时后 加入100 p1裂解液，于37°cit夜，第2天用酶联仪测定 0d540,连续测定6天。定向诱导uvmsc向成骨细胞分化的方法与鉴定收集消化后uvmsc,按3 000/cm2接种于6孔板内，成骨 的诱导体系为：地塞米松0.1 umol/l. b 甘油磷酸钠10 mmol/l.抗坏血酸磷酸盐 50 umol/l. 10% fbs、高糖 dmem, 每3天全量换液，维持3

13、周，然后进行碱性磷酸酶检测，方 法同文献6。定向诱导uvmsc向脂肪细胞分化的方法与鉴定收集uvmsc后按9 000/cm2接种于6孔板内，待细胞贴 壁后，加入脂肪诱导体系：地塞米松1 umol/l、ibmx 0.5 umol/l、消炎痛 200 umol/l. 10% fbs、高糖 dmem,每 3 天全量换液，维持3周，然后进行油红染色，显微镜下观察 细胞内脂肪小滴形成情况。定向诱导uvmsc向软骨细胞分化的方法与鉴定收集第3代到第5代细胞，取2x105细胞放于15 ml塑 料管内，300xg离心10分钟，弃上清液，加入0.5 ml软骨 培养体系，包括：its a 5卩1、地塞米松0.1

14、pmol/l. 抗坏血酸磷酸盐50 umol/l,丙酮酸钠1 mmol/l、tgf b3 10 ng/ml、高糖dmem补足0. 5 mlo每3天全量换液，培养 3周后，石蜡包埋，切片，进行甲苯胺蓝染色鉴定。结果形态学观察iv型胶原酶消化的细胞接种72小时后全量换液。此时可 见少量形态各异的细胞贴壁，散在分布。1周左右，贴壁细 胞形成集落，绝大多数细胞呈纺锤形或成纤维样细胞，与骨 髓来源的msc形态相似。细胞折光性较好，核仁明显，胞体 较骨髓msc大，且胞体较宽（图1a）。同时可见少量鹅卵形 细胞，可能为脐带静脉内皮细胞。约14天后，细胞可长至 80%-90%融合，用0.05%胰蛋白酶 edt

15、a消化。传代1-2次 后，细胞形态变得较为均一，脐带静脉figure 1. morphology of mscs from perfusion of umbilical cord vein (uvmsc) a： uvmsc in primary culture for one week b： uvmsc at passage 5, reaching a 100% confluence and forming a vortex arrangement(10 x10)内皮细胞得到抑制。将培养液更换为含有bfgf(10 ng/ml) . 2 mmol/l谷氨酰胺的10% fbs的a mem。细胞长

16、100%融合时，细胞呈漩涡状(图1b),细胞可培养20代以上。uvmsc的免疫表型分析对第5代uvmsc进行流式细胞术检测，结果发现uvmsc 高表达 cd29、hla abc、cd166、cd105、cd73、cd44,不表 达 cd34、cd14、hla dr、cd45、cd31、cd 144 (图 2)。这 表明人脐带静脉灌注液来源的msc不表达造血前体细胞标志 cd34、白细胞抗原cd45、单核细胞/巨噬细胞表面抗原cd14, 也不表达内皮细胞表面抗原cd31、cd144,这证明脐带静脉 灌注液来源的msc为非造血、非内皮类细胞。msc表达的表 面标志具有非单一性，即cd29、figu

17、re 2. facs analysis of cd166> cd105、cd73、cd31 > cd29、cd144、cd34、hla abc、cd45hla dr、cd44 fromuvmscs at passage 5.cd44、cd73、cd105、cd 166等，与骨髓、脐血等其它组 织来源的msc的流式细胞术检测结果一致，说明脐带静脉灌 注液来源的成纤维样细胞是一群细胞形态均一，且与骨髓来 源的msc有同源性的细胞。uvmsc的细胞周期检测取第5代细胞进行细胞周期检测，发现有73. 72%的细胞 阻滞于g0/g1期，与骨髓及脐血来源的msc 致。uvmsc的细胞生长曲线取

18、第5代细胞进行生长曲线测定，发现uvmsc的倍增时 间为31小时，培养6天后其0d值增加24倍，说明是一群 增长旺盛的细胞（图4）。成骨诱导分化结果uvmsc成骨诱导分化3周后，细胞胞体变宽，呈多边形， 且碱性磷酸酶酶染色为阳性（图5 a）o成脂肪诱导分化结果uvmsc成脂肪诱导分化3周后，细胞胞浆内出现脂肪小滴, 油红染色为阳性（图5b）o成软骨分化结果uvmsc成软骨分化3周后，甲苯胺蓝染色阳性（图5c）o讨论干细胞移植是一种新兴的治疗手段。msc 类具有自我更 新及多向分化潜能的组织干细胞，在特定条件下向成骨、成 脂肪、成软骨及神经细胞分化。作为多种骨髓基质的祖细胞, msc还具有稳定和

19、修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、 分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学 效应2。msc最早发现于骨髓，但骨髓来源困难，且骨髓 msc随年龄增加其分化及增殖能力均减弱，因此寻找新的来 源有重要意义。骨髓、脐血以及多种实质器官（肝脏、肾脏 及肺脏等）均能分离出msc。通过上述工作，我们在脐带静 脉灌注液内成功分离到间充质干细胞，后者在散在分布时呈 纤维细胞状，当100%接触时呈漩涡状，其73. 72%的细胞阻 滞于 g0/g1 期，强表达 cd29、hla abc、cd 166、cd105、 cd73、cd44,不表达造血及内皮标志，同时可以在体外向成 骨、成脂肪、成软骨细胞分

20、化，与骨髓msc 致。这些结果 说明，我们在人脐带静脉灌注液获得了一群形态均一，可在 体外进行稳定分离、大量扩增、并且可多向分化的间充质干 细胞。与我们以往分离的骨髓来源的msc相比，两者细胞形 态、表面标志和分化特性相似，均可向成骨、成软骨及成脂 肪细胞分化，且uvmsc细胞周期和诱导成骨的时间长于骨髓 来源的msc,更易向成脂肪细胞分化。这也证实了成体干细 胞的理论，即在成体多种组织中都存留有间充质干细胞，它 们是胚胎发育过程中存留于各种组织中的。脐带静脉作为分 娩废弃物来源广泛、取材方便、不受伦理限制，因此将其作为msc的新来源，则对基础研究和临床应用很有意义。【参考文献】1caplan al. mesenchymal stem cells j or