仔猪粪便中乳酸菌的分离,鉴定及其抑菌特性的研究

1、仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究张素辉，曹国文，徐皆峰，王孝友，蒋女(車庆市畜牧科学院 荣昌402460)摘要从健康仔猪新鲜粪便屮分离至u3株乳酸菌，对其进行了属利种的生化鉴定，结果为，菌株la与lt均为嗜酸乳杆 菌(lactobacillus acidophilus'), ls为乳酸乳杆菌lactobacillus lactis)对分离的三株乳酸菌的代谢产物进彳亍了体夕卜 抑菌试验研究，结果农明，3株菌乳酸歯代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色匍萄球菌都有较明賊的抑制作川； 对金黄色痢萄球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次z,对大肠杆菌的抑菌效果相对较弱。关键词：乳酸菌；分离

2、鉴定；抑菌特性is olation-iden tifica tion and bac terios tas is -bacterios tas is of lactobacillus from piglet7 s diachoremazhang suhui, cao guowcn, qiu jinjic, xu dcngfcng, wang xiaoyou, jiang-an(chongqing academy of animal sciences chongqing rongchang)abstract isolated 3 strains lactobacillus from piglet

3、's fresh fcccs and identified its genus and strain” results arc: the ls strain is lactobacillus lactis, the la and lt strains arc lactobacillus acidophilus. and carried the metabolic product of three strains in the study of inhibition activity. these experiments proved that, all the lactobacillu

4、s' metabolite had apparent inhibition to colibacillus, salmonella and staphylococcus aureus, had the most bacteriostasis result to staphylococcus aureus, salmonella was next to, and the effect with colibacillus was more feeblekey words lactobacillus； isolation and identification ； inhibition-act

5、ivity仔猪腹泻，是引起起仔猪生长受阻和死亡的重要原因之一，一直是困扰养猪业发展的难题。据资料统计，我国仔猪死亡率一般波动在15-252丿制龄以内死亡率为26%, 2-4周龄的死亡率为16%,断奶前后因腹泻而导致的死亡占总死亡率的49.11%山。以前常采用在断奶仔猪饲粮中添加抗牛 素的办法来控制腹泻，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了动物体内微生物菌群的平衡, 增加了消化道疾病的发牛。同时病原体的耐药性问题越來越严車，部分抗菌药物在畜产品中的残留 等対人类健康构成极大威胁。研究和开发无毒、无副和无残留的生物药品c成为热点课题，近年來, 微牛态制剂越来越受到众多人士的青睐，微牛态调节剂

6、是根据微牛态学原理，调整微生态平衡的制 剂。微牛态疗法是根据微牛态学原理，用微牛态制剂扶持和恢复肠道菌群的平衡以达到预防腹泻的 目的。1998年aafco年鉴公布了43种对用作益牛素的菌种，其中半数以上是乳酸菌(lactic acid bacitenafo乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色。木研究的日的是从健康仔猪的 新鲜粪便中分离出在体外具有广谱抑菌杀菌效果的乳酸杆菌菌株，从而为开发应用于防治仔猪腹泻 疾性病的微生态制剂提供理论依据和菌种保证。作者简介：张素辉(1980-),女，研究实习员。从事动物微牛态制剂与新兽药的研究。1材料与方法1.1材料1.1.1样品健康乳猪新鲜粪便，

7、采白多个规模化养猪场。1.1.2培养基增菌及分离培养基：改良mrs培养基。微量生化鉴定管：购自杭州微生物试剂有限公司。1.2方法121菌株的分离在改良mrs液体培养基中加入适量的新鲜乳猪粪便，富集培养24小时后，用接种环取培养液 划线接种于改良mrs琼脂平皿，375氧培养48-72h,挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作 纯培养，并进行镜检观察分离细菌的染色及形态特征。122分离菌的鉴定挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽胞杆菌：作硝酸盐还原试验，明胶液化试验，过氧化氢酶 试验，靛皐质试验和硫化氢试验；作七叶昔、纤维二糖、麦芽糖、廿露醇、水杨昔、山梨醇和蔗糖 发酵试验。123乳酸菌对常见肠道致病

8、菌的抑菌试验乳酸菌新鲜培养液，按2%(v/v)接种于mrs液体培养基中，静置培养1824h,取适量培养液， 5000rpm,离心30min,吸取上清液备用。临床分离保存的人肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌经活化后，接种于普通肉汤屮培养12h, 川灭菌吸管分别吸取各菌液培养物0.5ml于普通营养平皿中，用l棒均匀涂布，待琼脂表而水分干燥 后，在平板表面放置火菌的牛津杯，取制备的乳酸菌上清液于牛津杯内测定其对常见肠道病原菌(人 肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)的抑菌活性，置37°c培养10h,观察并测定抑菌圈的人小。 同时设立相应代谢产物ph值相同的mrs液体培养基作对照。判定标准为：

9、抑菌圈直径4 mm判定为不敏感；抑菌圈5-10 mm判定为低度敏感抑菌圈直径 11-15 mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大t15mm判定为高度敏感。2结果2.1木试验分离得到3株乳酸菌，编号分别为la. ls、lt, k菌落特征、菌体形态及染色特征见表u表1乳酸菌菌落特征.菌体形态及革兰氏染色结果table 1 characteristics of colonies and results of gtaining cells of lactic acid bacteria菌株菌落特征革兰氏染色菌体形态strainscharacteristics of coloniesgstainingmorp

10、hology of bacteiala微白色,露滴大小，圆形，微凸,g+两端钝圆，中等人，无芽饱杆菌;mrs固体培养基上培表而粗糙，边缘不整齐养物呈散在排列；mrs肉汤培养物呈单个散在扌if列ls微白色，露滴样人小，圆形,隆起，g+两端钝圆，无芽抱小杆菌；mrs固体培养基上培养物呈表面光滑，边缘不整齐散在或短链状排列；mrs肉汤培养物成短链状排列lt微白色，籍滴大小，1员1形,隆起，g+两端钝恻，屮等大，无芽泡杆菌：mrsi占i体培养基上培表面粗糙，边缘不整齐养物呈散在排列；mrs肉汤培养物呈单个散在排列22各菌株的鉴定根据革兰氏染色镜检可知，la. ls、l(菌为革兰氏阳性的无芽泡杆菌。生化

11、实验表明，它们均 不能利用硝酸盐，过氧化氢酶试验和靛基质试验阴性，不液化明胶，不产牛硫化氢。依据这些菌株 糖发酵试验的结果(见表2),参见们杰细菌鉴定手册(第八版)，最终鉴定为：菌株la为嗜 酸乳杆菌(lactobacillus acidop hilus),菌株 ls 为乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis ),菌 株 lt 为嗜酸 乳杆菌(lactobacillus acidophilus)表2乳酸杆菌属种的碳水化合物反应table2 carbohydrate-reaction of species in cillobacterium菌株七叶昔纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨昔山梨醇

12、戲糖la+ls+lt+土+注”表示90%或90%以上的菌株为阳性反应；“一”表示人多数菌株（90%或以上）为阴性反应土”表示有 些菌株为阴性，其他菌株为阳性。note: " +''demonstrates 90% or more than 90% strains which arc positive reaction; ""demonstrates strains which arc negative reaction; "idemonstrates some of strains are positive reactions,the o

13、ther are negative reaction.2.3乳酸菌代谢产物对常见肠道致病菌的抑菌试验结果由表3可以看出，3株菌乳酸菌代谢产物对3株病原指示菌都有较强的抑制作用，所有菌株对 金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径在18-23mm之间，各菌株抑菌圈直径由人到小依次为 ls、lt、la；对沙门氏菌的抑制效果相对较低，抑菌圈直径在14-17mm z间，各菌株抑菌圈直径由 人到小依次为ls、la和lt；对人肠杆菌抑菌圈在15-i9mm之间，各菌株抑菌圈宜径由人到小依次 为 ls、ln 和 lt。比较la、ls、ll菌株对沙门氏菌抑菌效果发现，lslw株代谢产物的抑制效果最明显，其抑菌圈

14、直径极显苦人于la、lt斷(p<0.01)；la菌株对沙门氏菌的抑制作用高于l(菌株，差异显箸(p<0.05)。la、ls、lt菌株对人肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效杲均存在极显著差异(p<0.01)o表3不同乳酸菌菌株代谢产物对沙门氏菌、人肠杆菌和金黄色徊萄球菌的抑菌圈直径(单位:帧)table3 the bacteriostasis-diameter of the metabolic product of three strains to the salmonella, colibacillus.staphylococcus aureus (unit, mm)沙门氏菌大肠

15、杆菌金黄色葡萄球菌la14. 6±0广16. 6±0. 3a1& 3+0. 3*'ls16. 5±0. 2b18. 5±0, 2822.6+0. 2nlt14. 2±0. 2"15. 8±0. lc21.5+0. 5r注：表中的抑菌圈直径以平均值土标准差表示。用标字母不同者表示差界显著，人写字母代表p<0.01,小写字母代 表p0. 05,无标记或字母相同者表示差异不显著p>0. 05。note: the bacteriostasis-diameter in the table was denot

16、e by "average value ± tandard deviation the shoulder noted by different letter expressing notable difference, majuscule represent (p<0.01), minuscule represent (p<0.05), no signs or identical letter indicate the difference is not quiet (p>0.05).3讨论目前，许多报道显示，微生态制剂不但能提高机体的生长性能，而口能降低

17、肠杆菌科细菌在 胃肠道各部位定植水平而影响肠道菌群的微牛态平衡，专业人士越来越多地注意到饲喂乳酸菌微 牛态制剂能够影响肠道菌群的微牛态平衡，vanschic (1987)认为乳酸杆菌的乳酸和挥发性脂肪 酸在降低肠杆菌科细菌如沙门氏菌在肠道定植具有重要作川。乳酸菌在培养过程中可以产生有机酸 (如挥发性脂肪酸、乳酸、丁酸、酷酸等)、双乙酰、过氧化氢、细菌素等化合物及大量的乳酸杆菌和 低ph环境，这四个要素均能独自地或共同地作用于胃肠道菌群，这些混合物的分子量、生物化学性 质、抑菌范围各不相同。人们对乳酸菌益牛素的研究热点集中在采用新方法分离或开发新的益牛素菌种上。陈世琼罔认 为，从菌种的安全性以及

18、对宿主肠道的粘附性考虑，益生素菌种最好采川分离自宿主肠道优势菌中 的优良菌种；另外，为节约牛产和技术成本，应从宿主体内分离耐氧的菌种。当然也可使用改造后 仍然安全的菌种，但需做毒理学实验验证其安全性。本研究采用改良mrs培养基，英中含有高浓度 的乙酸盐离子，低ph值5.4,并有刺激因子吐温-80, nj'抑制其它许多微牛物的生长，起到选择培养 的作用，因而能从粪便这样的复杂区系中选择培养出乳酸菌。在整个培养过程中均采取有氧培养， 分离出的乳酸菌为兼性厌氧菌，为今后的研究和牛产减去了较为复杂的厌氧培养条件。乳酸杆菌的代谢产物通过影响有害菌的定植黏附及抑制其生长而达到保护机体的作用，这些

19、代谢产物町以是低分子量或者高分子复合物，后者被认为是质粒编码的蛋白质，即细菌素，目前已经有许多关于乳酸杆菌细菌素的报道l10' hjo木实验在筛选出1株乳酸乳杆菌(.lactobacillus lactis 2株嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus的基础上，通过牛津杯平板扩散实验对所分离到的乳酸 菌菌株进行体外抑菌试验，发现所分离的3株乳酸菌发酵上清液令较强的抑菌活性，而相同ph值条 件下的mrs培养基液在相同条件下没有抑菌活性，从而排除了酸的作用。这与hi召芳(2003)阳的结 果相一致，说明乳酸菌代谢产物中可能含有细菌索等其它抑菌物质的存在。实验室及临床实验

20、研究表明，乳酸菌对肠道细菌如大肠埃希菌、沙门菌等引起的肠道感染有拮 抗作川3,木实验分离乳酸菌的抑菌试验也证实了这一论点，尤其是对致病性大肠埃希菌有抑菌活 性，町以作为益生素制备用菌株，该研究为开发应用该分离乳酸菌提供了理论依据和菌种保证。参考文献：【1】兰罗勋.仔猪腹泻综合防治初探，畜牧兽医杂志2006,25(6)80-82.2 ewing wn. the living gutm. university of notinghan.england, 1994, 49.【3】张文鑫，龚伟.四种活菌剂对仃潴黄痢病原菌的体外抑菌试验，云南农业大学学报,1997,12(2):133-136.4 布坎南

21、re上编.伯杰氏细菌鉴定手册m.笫8版.北京:科学出版ftj984. 677-830.5 geary t. m, p. h. brooks, t. morgan,etal. performance of weaner pigs fed ad libitum with liquid feed at differentdry matter concentrations. j. sci. food agric. 1996,72:17-24.6 vanwinsen r l., b a. purlings, l a. lipman,et al. effect of fermented feed on the microbial population of thegastrointestinal tracts of pigs. applied and environment microbiology, 2001, 67,(7): 3071-30767 prohaszka. l,b. m. jayarao, a. fabian,etal. the role of in