AFFYMETRIX基因芯片操作流程

1、1AFFYMETRIX基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备<一> RNA 的抽提一、哺乳动物细胞或组织RNA 的抽提1.总 RNA使用 QIAGEN sRNeasy Total RNAIsolation kit 成功抽提哺乳动物细胞总 RNA.哺乳动物组织作为RNA 的来源，建议使用TRIzol 抽提总 RNA.2.Poly(A) + mRNA哺乳动物细胞使用QIAGEN s Oligotex Direct mRNAkit, 从总 RNA 中抽提 mRNA .哺乳动物组织作为RNA 的来源，应首先使用 TRIzol 纯化，再进行一个 Poly(A) +mRNA 分离步骤或使用 ki

2、t.二、RNA 沉淀1. 总 RNA在用 RNeasy Total RNA Isolation kit 分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA. 调整洗脱体积以制备 cDNA 合成接近希望的 RNA 浓度。注：为获得足够量的标记 cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX 建议开始合成 cDNA 的 Poly(A) + mRNA 最小浓度为 0.02 g/ l 时的最小量是0.2 g, 总 RNA 最小浓度为 0.5 g/ l 时的最小量是 5 g. 这样有两个好处：（ 1）有足够量在各步检查样品浓度和质量（ 2）制备足够的 cRNA 用于杂交在 TRIzol 分离和热酚提取后需要

3、乙醇沉淀；见下面方法.2. Poly(A) + mRNA大多数 Poly(A) +mRNA 分离过程都会导致得到较稀浓的RNA ，所以需要在 cDNA 合成前浓缩 mRNA.3.沉淀步骤：（ 1） 加 1/10 体积 3M NaOAc,PH5.2, 和 2.5 倍体积乙醇 .（ 2） 混匀， -20放置最少 1 小时 .（ 3） 4 ,12000x g 离心 20 分钟 .（ 4） 80%乙醇洗涤沉淀 2 次 .（ 5） 空气干燥沉淀 .继续下面步骤前检查是否干燥 .（ 6） DEPC 处理水重新溶解沉淀 .最合适的溶解体积由cDNA 合成中需要的RNA 的浓度和量来决定 .先阅读 cDNA

4、合成的过程来决定这一步的适合溶解体积.4.RNA 测定用分光光度计分析 RNA 浓度，在 260nm 1 单位吸光度等于 40g/mlRNA.需要在 260 和 280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度A260 /A 280 应接近 2.0 为较纯的 RNA( 比值在 1.9-2.1也可 )<二>由纯化的总 RNA 合成双链 cDNAAFFYMETRIX强烈建议HPLC 纯化 T7-(d7) 24 primer2一、第一链 cDNA 合成开始 RNA 的量 :高质量 RNA5.0 g -40.0 g纯化后 RNA 浓缩由 260nm 吸光度决定（1 单位吸光度 =40 g/ml

5、RNA ）， A 260/A 280 应接近2.0，在 1.8-2.1 的范围内。建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定RNA 质量。 rRNA 条带应该比较清晰没有明显的托影。cDNA合成前， DEPC 处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的RNA 浓度和总体积决定。表 1.1第一链 cDNA合成反应逆转录体积总 RNA （ g）SuperScript RT( l),200U/ l5.0-8.01.08.1-16.02.016.1-24.03.024.1-32.04.032.1-40.05.0RNA和 SuperScript RT 体积不要超过 12 l合成反应应在 1.5ML离心管中

6、进行（ RNase-free）表 1.2第一链 cDNA 合成成分反应试剂体积反应中最后浓度或量1:PrimerDEPC 水到反应最后体积20Hybridization l70放置 10 分钟T7-(d7) 24 primer1 l100pmol稍微离心， 放置冰上RNA5.0-40 g5.0-40 g2:温度调节5× First strand cDNA4 l1×加到相应管子混合buffer均匀0.1M DTT2 l10mM DTT42放置 2 分钟10mM dNTPmix1 l500 M each3: 第一链合成SuperScript RT见表 1.1200U-1000U

7、加到相应管子混合(200U/ l)均匀42放置 1 小时总体积20l二、第二链 cDNA 合成1. 第一链反应放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂2. 在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表1.3）3表 1.3第二链 cDNA 合成成分成分体积反应中最后浓度或量DEPC 处理水91 l5× Second strand cDNA buffer30 l1×10mM dNTP mix3 l200 M each10U/ l E.coli DNA ligase1 l10U10U/ l E.coli DNA polymerase I4 l40U2 U/ l E.coli Rnase

8、H1 l2U终体积150 l3. 混匀。稍微离心， 16放置 2 小时4. 加 2 l 【 10U】 T4 DNA polymerase5. 16放置 5 分钟6. 加 10 l 0.5M EDTA7. 继续纯化 cDNA 步骤 ,或 -20储存<三>纯化双链cDNA一、 Phase Lock Gels (PLG)-酚/氯仿提取1. 12000g 离心 PLG 管 20-30 秒，离下管壁PLG2. 加 162 l（等体积）的（ 25：24：1）酚：氯仿：异戊醇（ 10mM Tris-HCL PH8.0,1 mM EDTA 饱和）到 cDNA 最后合成产物中（ 162 l），最后体

9、积到 324 l 。混匀，稍微离心。3. 转移上液至 PLG 管4. 不要混合， PLG 会混入溶液中。 12000g 离心 2 分钟5. 转移上层水相到一个新的 1.5ML 离心管中。二、乙醇沉淀1.加 0.5 倍体积 7.5M NH 4OA C 和 2.5 倍体积乙醇（-20储存）到样品中，混匀2.立即在室温下12000g 离心 20 分钟3.去上清， 0.5ML 80% 乙醇（ -20储存）洗涤沉淀4. 在室温下 12000g 离心 5 分钟5.小心去掉80%乙醇， 80%乙醇再洗涤一次6. 空气干燥沉淀 .继续下面步骤前检查是否干燥7. 12 l Rnase-free 水重新溶解沉淀。

10、<四>生物素标记 cRNA 合成参考 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit4表 1.4 cDNA in IVT( 总 RNA)总 RNA （ g）IVT 中 cDNA 体积5.0-8.010 l8.1-16.05 l16.1-24.03.3 l24.1-32.02.5 l32.1-40.02 l表 1.5cDNA 体外转录成分成分体积纯化后的 cDNA （含总 RNA ）5 l水（ Rnase-free）17 l10× HY Reagent buffer4 l10× Biotin Labeled Ribo

11、nucleotides4 l10× DTT4 l10× Rnase Inhibitor Mix4 l20× T7 RNA Polymerase2 l终体积40 l37， 4.5 小时， 600rpm 振荡 10 秒 /35分钟<五>纯化和质控体外转录（ IVT ）产物一、体外转录纯化不要用酚-氯仿提取生物素标记RNA, 生物素能导致部分RNA进入有机相，得到的量会减少。保存部分没纯化的IVT 产物凝焦电泳分析。建议先纯化一半IVT 产物，在纯化另一分前测定cRNA 量。如果样品在纯化过程中丢失，则可用保存的另一部分。如果 IVT 产物量很高， RNA

12、的量则会超出纯化能力。纯化后的 cDNA 的最小浓度是0.6 g/ l。建议的 IVT 纯化方法（1）QIAGENRNeasyColumns( 优先方法 )（2） CHROMASPIN-100(size exclusion spin columns)+EtOH沉淀那么纯化一半更好一点。QIAGENRNeasyColumns纯化见试剂盒中参考手册建议：1.洗涤和洗脱之前将样品过柱两次。2.洗脱 RNA 时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。CHROMASPIN-100s 和 EtOH 沉淀法纯化1.加 RNase-free 水(60 l) 到 IVT 反应是体系至100 l 。2.50 l （一半

13、）样品装入柱子。3.50 lRNase-free 水洗柱，在用流过柱子的样品洗柱。5二、乙醇沉淀（只适用于第二种纯化方法）1.加 0.5 倍体积 7.5M NH 4OA C 和 2.5 倍体积乙醇（-20储存）到样品中，混匀。2.-20沉淀 1 小时 -过夜。3. 4， 12000g 离心 30 分钟。乙醇（ -20储存） 洗涤沉淀2 次。空气干燥沉淀 .继续下面步骤前检查是否干燥。5.10-20 l RNase-free 水重新溶解沉淀。三、 cRNA 质控用分光光度计分析RNA 浓度 .需要在 260 和 280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度A260 /A 280 应接近 2.0

14、为较纯的 RNA( 比值在 1.9-2.1 也可 )下面的计算公式确定调整cRNA 的含量 :调整 cRNA 含量 =RNA m-(total RNA i)(y)RNA m=IVT 后测得 cRNA 量 ( g)total RNA i =开始总 RNA 的量( g)y= 在 IVT 过程中使用的Cdna 的倍数四、凝胶电泳检测样品同时跑纯化和没有纯化的IVT 产物有助于检测纯化过程丢失的范围。0.1%琼酯糖凝胶电泳分析0.1%的样品RNA 和 loading dye 混合，加热到65， 5 分钟<六>片断化 cRNA1.在新的 1.5mL RNase-free 离心管中按表表 1.

15、6 片断化反应成分体积1.6 加入样品20 g cRNA1-32 l5× Fragmentation8 lBufferRNase-free 水到 40l2. 94， 35 分钟。然后放置冰上。3.变性凝胶电泳，至少需要1 g cRNA 。4. -20储存样品第二章杂交1. 在新的 1.5mL RNase-free 离心管中按表2.1 加入样品6表 2.1杂交液成分Micro/MiniMidiStandard终浓度ArrayArrayArray片断化 cRNA5g10g15 g0.05 g/ lControl Oligonucleotide1.7 l3.3 l5 l50pMB2 (3n

16、M)20×Eukaryotic5l10l15 l1.5,5,25,100pMHybridization Controlsrespectively(bioB,bioC,bioD,cre)Herring Sperm DNA1l2l3 l0.1mg/ml(10mg/ml)Acetylated BSA1l2l3 l0.5mg/ml(50mg/ml)2×Hybridization50l100 l150 l1×Buffer水至 100 l至 200 l至 300l终体积100 l200 l300 l20× Eukaryotic Hybridization Contr

17、ols冻存，使用前65， 5 分钟2.使用前室温平衡探针3.99， 5 分钟4.通过加样孔加入适量体积（见表2.2） 1× Hybridization Buffer湿润芯片5.45， 60rpm 预杂交芯片10 分钟6. 步骤 3 处理过的样品 45， 5 分钟7. 最大速离心 5 分钟8. 从芯片中取出 Buffer ，加等体积处理好的杂交液9. 45， 60rpm 杂交芯片 16 小时表 2.2Array杂交体积总体积Standard200 l250 lMidi130 l160 lMini80 l100 lMicro80 l100 l第三章洗脱、染色、扫描芯片<一>实

18、验和洗涤工作站设置一、进入 Experiment Information洗脱、染色、扫描芯片之前都必须先定义一个Experiment二、准备洗涤工作站基因芯片洗涤工作站400 用来洗脱和染色探针阵列。7<二>洗脱和染色1.杂交 16 小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管，放置冰上或 -80长时间保存。2. Wash Buffer A 充满芯片3.配制下列溶液表 3.1SAPE 液（使用前配制， 4储存）成分体积终浓度2× MES Stain Buffer600.0 l1×50mg/ml acetyed BSA48.0 l2mg/ml1mg/ml Stre

19、ptavidin-Phycoerythrin(SAPE)12.0 l10 g/mlDI 水540.0 l总体积1200 l表 3.2 抗体溶液成分体积终浓度2× MES Stain Buffer300.0 l1×50mg/ml acetyed BSA24.0 l2mg/ml10mg/ml Normal Goat IgG6.0 l0.1mg/ml0.5mg/ml biotinylated antibody3.6 l3 g/mlDI 水266.4 l总体积600 l4.洗涤工作站按表3.3 工作表 3.3标准格式EukGE-WS2Post Hyb10cyclesof2Wash#

20、1mixes/cycle with WashBuffer A at 25 Post Hyb4cyclesof15Wash#2mixes/cycle with WashBuffer B at 50 StainStain the probearrayfor10minutesinSAPE solution at 25 Post10cyclesof4Stainmixes/cycle with WashWashBuffer A at 25 2ndStaintheprobe arrayStainfor10minutesinantibodysolutionatMidi 格式Midi-euk210 cycle

21、s of 2 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 6 cycles of 15 mixes/cycle with Wash Buffer B at 50 Stain the probe array for 5minutes in SAPE solution at 35 10 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 Stain the probe array for 5minutes in antibody solution at 35 Micro/Mini格式Micro-1v1/Mini-euk21

22、0 cycles of 2 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25 8 cycles of 15 mixes/cycle with Wash Buffer B at 50 Stain the probe array for 10minutes in SAPE solution at 25 10 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 Stain the probe array for 10minutes in antibody solution at 25 2583ndStainthe probearr

23、ayStain the probe array forStain the probe array forStainfor10minutesin5minutesinSAPE10minutesinSAPESAPE solution at 25 solution at 35 solution at 25 Final15cyclesof415cyclesof415cyclesof4Washmixes/cycle with Washmixes/cyclewithWashmixes/cyclewithWashBufferA at30 TheBuffer A at 35 Buffer A at 35 holding temperature isThe holding temperatureThe holding temperature25is 25is 25<三>扫描<四>关闭洗涤工作站附：溶液配制5× RNA Fragmentation Buffer:(200mM Tris-acetate,PH 8.1,500mM KOAc,150mM MgOAc)4.0ml1M Tris-acetate,PH 8.1( 冰醋酸调节PH)0.64gMgOAc0.98gKOAcDE