感受态制备、蓝白斑筛选

1、感受态细胞的制备 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选复习：基因克隆示意图DNA+基因克隆操作过程:分离载体和目的基因限制酶切载体与目的基因拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA分子基因工程攣体外擦一、感受态细胞及重组体转化重组体桂入受体前7受体细胞转化（transformation J 转染（transfection j 转导（transduction J重组DNA分子导入受体细胞的手段转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞;转导则是指病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体时），发生供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重

2、组。转化方法 CaCJ诱导转化电穿孔 PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变受体细菌50-100mmol/L f感受态细重组体转入细 菌CaCl?处理感受态(competent):宿主细胞处于容易 吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞 称为感受态细胞.正常细胞都有细胞膜(细菌还有细胞壁)作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。制备感受态细胞和转化的常用方法CaC.转化程序法：传统方法，转化效率能达到 5x106 2x107转化子/昭质粒DNA,简单、快速、 重复性好、菌株适用范围广。电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、

3、胞核的显微 注射法(microinj ection)；磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法;C锁q法制备感受态细胞和转化的原理一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低, 难以转化成功。当细菌处于冰冷(0°C) 005 0.1M的CaC.低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球 形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增 强，转化效率提高(感受态细菌)O同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的疑基钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42C 短时间热休克(heat shock)处理，促进感受态细 胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后, 球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在

4、转化细菌中得到表达,在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。0.1mol/LCaCI20°C重组体转化与感受态细胞(transformation):在分子克隆技术中，转化特 指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的 过程。区别转化、转染(transfection)与转导(transduction)二、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项细菌转移到一冰冷的l5ml的EP管，4°C, 4000rpmX 5min弃上清，沉淀中加入冰冷的O.lmoVL CaCl23001,重悬菌体，冰浴20min4°C, 4000r

5、pm X 5min弃上清，将管倒置于滤纸上lmin,使液体流干净沉淀中加入冰冷的O.lmoVL CaCl2 lOOpl,重悬菌体。冰浴lOmin冰浴lOmin后每管加入质粒5卩1轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20“试管放入42C的水浴中，放置90s,不要摇动试管迅速将试管转移到冰浴，冷却umin置于37吃摇床(100150r/min),温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将200口菌液铺于含Amp的琼脂平板表面室温放置20min,使液体被吸收(发汗)倒置平皿，37C培养，12小时可见菌落生长三、重组体的筛选重组体克隆的霾选与養走由于重组率和转化率不可能达到理想极限,此必须借助各种筛选

6、和鉴定方法得到含有重组DNA 的阳性克隆。筛选的依据: 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。筛选的方法:抗药性标志的选择插入表达筛选0半乳糖昔酶系统筛选（4互补）（卩半乳糖昔酶能将Xgal转变为不溶性的深蓝沉淀）ApRTcRApRTcRpBR322Bam HI(插入失活法)抗药性标记选择外源DNA Bam HI片段M叵回落杂交筛选法内切酶图谱鉴定PCR筛选重组子Southern印迹杂交和菌落原位杂交DNA序列分析免疫化学检测法蓝白斑实验原理：基因载体上含有B半乳糖昔酶（LacZ）的 基因，当外源DNA插入到载体的La"基因上后将 造成B半乳糖昔酶失活，就不能分解培养基中的

7、X gal（5漠4氯引喙半乳糖昔）产生蓝色产物, 结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG1=（异丙基©D硫代半乳糖昔）培养基的颜色变化 直接观察出来。多克隆位点裂开的N端a互补的检测pUC182686bp转化B -半乳糖昔酶N端编码序列启动子染色休含载体pUC18 的蓝色菌落pUC182686bp外源DNA U6裂开的N端蓝色菌落膜板维养纤培原位杂交鉴定克隆（含感兴趣DNA）理处酶菌和白洗干 溶中蛋漂拱 自显影Southern 印迹基因x限制性厂哆/ Dna核酸内切酶趣;-2；> : 林一 1 碱变性e< 2«Southeni 印迹3 加热80弋e胶电泳硝酸纤维膜放射自显形与基因x序列互补的 知探针(DNMfcRNA)含基因x的片段位置胶片亡祐 ¥BcoRISaJl蛋白质结合在沪膜上1标记