伪狂犬病活疫苗

1、日 年 月 :审核人 年 月 编制人: 日 伪狂犬病活疫苗 (Bartha-K61株)生产工艺规程 :批准人 一、 U 的：伪狂犬病活疫苗（Barth3-K61 株）生产工艺规程的方法和程序。 二、 适用范用：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生产的全过程 三、 依 据：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）制造及检验试行 规程 四、 责 任 者：生产车间、质管部。 五、 正 文: I丄艺流程及质量控制要点 II操作细则 1、 制苗材料的制备 2、 生产用种毒的制备 3、 半成品的配制 4、 配苗 3、疫苗的分装 6、 疫苗的冻干 7、 轧盖贴标 8、 包装 III成品检验

2、 IV工艺卫生与人员卫生 V生产设备一览表 VI包装机检查方法 VII物料平衡 VIII劳动定员及劳动保护Fl月 吉林和元生物工程有限公司 GMP 管理文件. 伪狂犬病活疫 Bartha-K6 株生码 13- 工艺规 SOP-SC- 批准日审核日制定日颁发部办公生效日颁发数 办公室、生产技术部、质管部分发单位 一、 目 的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的方法和程序。 二、 适用范圉：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生产的全过程 三、 依 据：伪狂犬病活疫苗（B吐 thK61 株）制造及检验试行规程 四、 责 任 者：生产车间、质管部。 五、 正 文： 【

3、名伪狂犬病活疫苗 Bartha-K6 株 本企业伪狂犬病活疫苗 Bartha-K6 株）质量标准【质量标准 本品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解观【 【格 1 头瓶2 头瓶 7 头 -1 C 以下，有效期暂定 1【藏个 【作用与用途】用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征。免疫期为 4个月。 【用法与用量】1按瓶签注明的头份加生理盐水稀释，耳根后部肌肉注射。 2仔猪断奶前免疫 1 次，1头份/头。 3 母猪配种前免疫 1次，1 头份/头。 【成品代码】C 瓶】批【量 40000 I丄艺流程及质量控制要点 备毒制鸡胚成纤维细胞制及检验备种 旋转培养 收 获 半成品检验 格合不 配

4、 苗 无害化处理 装 分 冻 干 轧盖贴标包装 入检待库 品成检验 合格入成品库不合格入报废品库 销售理处化害无. 伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）质量控制要点 工序毒 质量控制要点质量 频次 种制备 控制项目 每批每批 每批 每批 每批 每批 每批 每批 每批 无菌检验 毒种 病毒含量时间、温度消化外 源病毒检验细 胞接种 接观察细胞再生状况无菌检 验 半成品检验病毒含量无菌检 验 配苗比例分装过程冻干曲线 细胞制备 毒液制备苗半成品、保护剂配 分装 量种 每批 分装过程中前、中.后检 无菌检验验间隔半小时标定分装量 每批批每每批每批 每批 每批每批批每 分装 量 共融点、真空度

5、理化指标 无菌检验 鉴别检验 效力检验 安 全检验 外源病毒检验 支原体检验 冻 干 品 成品检验 成 操作细则 II 本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳 定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。. 1 制苗材料的制备 1.1 条件准备 1.1.1 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 1. 1. 2 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工 作间待用。 1.1.3 在工作开始前 3040min,按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别 要求。 1.2 操作规则 1.2. 1 细胞的制备 1.2. 1. 1 制苗用细

6、胞的来源 发育良好的 910 日龄 SPF鸡胚。 2. 1.2 细胞制备 选择 910 日龄发育良好的 SPF鸡胚， 先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位， 无菌取 出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用 灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤 23次，然后加 0.25%胰 酶溶液（每胚 4ml）, 37.5385 C 消化 2030 分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏 液洗涤 23次再加入适量的营养液（用含 5%10%犊牛血清乳汉液，加适宜的 抗生素适量）吹打，用 46层纱布过滤，制成每 lml含活细胞数约 100150 万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层

7、后备用。 细胞培养物应无细菌、霉菌（见无菌（纯粹）检验标准操作规程）和支原体 （见支原体检验标准操作规程）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种 Marc-145 细胞，应不出现任何病变（见外源病毒检测标 准操作规程）。 2. 3 清场和记录 1.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废 弃物等应按规定分别进行处理。 4. 3. 2 全面填写生产工序记录。 2 生产用毒种的制备 2.1 条件准备 2.1.1 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。 2.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 ,按浄化级别要求调整送风量，达到洁净级别要

8、求。40min30 在工作开始前 5. 1. 3 2.2 操作规则 3. 2.1 制苗用病毒液的制备 2. 2. 2. 1 细胞单层培养 将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速 9、12 转/小时。 2.1.2 接种 取所需数量的、细胞覆盖率达到 80%以上的细胞转瓶，弃去生长 液，按2% （V/V）接种病毒，加入含 2制台牛血清的细胞培养液，37 C旋转（912 转/小时）培养。 2. 1. 3 收获 在显微镜下观察山病毒引起的细胞病变（CPE）,直至 CPE达到 70% 以上收获细胞培养物，反复冻融 1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40 C 以下。 2.2.2 毒种鉴定 2

9、. 2. 1 弱毒标准 个稀、10102. 2. 2. 2 病毒含量 将毒种用无血清培养基做 10倍系列稀释， 取10、10释度，分别接种于 96 孔细胞板，每个稀释度接种 6孔，每孔 O.lmL, 设置正常的细胞对找孔，：. TCID。病毒含量应 210 法计算，37 C 下培养观察 35 日,根据Reed-MuenchTCID5%C0 放置心 22. 2. 3 鉴别检验 JCID/mL,取 0. ImLlO 中和试验：将毒种用无血清培养基稀释成与等量呼吸综合 征病中毒特异性阳性血清混合，同时设病毒对照组和正常细胞对照组，37C 作用 1小时后，接种 Marc-145 细胞培养板，观察 5

10、日。应不产生细胞病变（CPE）。 2.2 病毒基因鉴定 应用下列引物进行 RT-PCR 检测，毒种可扩增出 581bp 的特异性条带，以而猪繁殖与呼吸综合征病毒 NVDC-JXA1-R株为代表的高致病性 猪繁殖与呼吸综合征病毒以及其他猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为阴性（猪繁殖 与呼吸综合征病毒 JXA1-R 株 RT-PCR 检测方法见附注 3）。 U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC D2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT 2. 2. 4 毒力 4.oTCID/mL）接种 46周龄抗原猪繁殖与 对仔猪的毒力用 JXA1-R-R株毒种（2 10訓乎吸综合征病毒、 抗体阴

11、性仔猪 （阴性猪标准见附注 1） 5头， 每头颈部肌肉 注射 2mL,同时设 5头阴性猪作对照，隔离饲养。接种猪逐日测量体温，观察临 床症状，均不发病（发病猪判定标准见附注 2）。 .oTCID/mL）接种怀孕 10用 JXA1-R-R株毒种（彳 80、90天的母猪 对妊娠母猪的 毒力也头，每头颈部肌肉注射 2mL,同时设同期怀孕母猪 3 头做对照，隔离饲 养，观察母猪临床症状和分娩产仔状况。怀孕母猪应不发生流产，所产仔猪的存 活率与未接种对照组无统计学差异。. 2. 2. 2. 5 免疫原性 取 46周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性猪（阴 性猪标准见 soTCID/mL）,另 5 头

12、作为对照， 5 头， 其中头肌肉注射 JXA1-R-R株 毒利 JmL （10附注 1） 10“同条件下隔离饲养。28 H后，所有猪肌肉注射检验用 强毒 NVDC-JXA1株病毒培养液（病毒TCID/mL） 3mL,每天测温并观察 21 含量 $10 日。对照猪均应发病，且至少 2头死亡，免疫猪应至少 4头保护（发病猪 判定标准见附注）。 2. 2. 2. 6 纯净 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外 源病毒污染。 2. 2. 3 基础种子代数 82、90代。 2.2.4 种毒保存 -70 C 下，保存期暂定为 12个月。 ?Numbered?Bulleted-Numbere

13、d_8286a19e-ff4f-436d-afa0-0701212d6f0a-Numbered_c35bacc3-45c6-49fe-ab3c-80ae5da9fe7b-Numbered_802ba14e-f126-41f9-b205-961f60c532e7-Numbered_94c61763-4180-4a62-a0cc-d0e7cdd3b67f-Numbered_fea6dd7d-6719-4b 2. 5 强毒标准 “说 4个稀 10、10102. 2. 5. 1 病毒含量 将毒种用无血清培养基做 10倍系列稀 释，取 10、释度，分别接种于 96 孔细胞板，每个稀释度接种 6孔，每孔

14、0. lmL, 在 37 C 下培养观察 57,YTCID/mL。法计算 TCID。病毒含量应$10日，根据 Reed-Muench呎 22. 5. 2 对猪的毒力 取 8、10 周龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗 原抗体阴性猪（阴性猪标准 zTCID/mL） 103mL,每天测温（见附注 1） 5 头, 每头猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1-弘并观察 21 Bo猪均应发病，且至少 2 头死亡。 1.3.3 毒种代次 56代。 2.2.6 毒种保存 在-70 C 以下，保存期暂定为 12个月。 3 细胞系 病毒培养用细胞为 Marc-145, ill中国动物疫病预防控制中心鉴定、保管和供应。

15、 ?Numbered?Bulleted-Numbered_8286a19e-ff4f-436d-afa0-0701212d6f0a-Numbered_c35bacc3-45c6-49fe-ab3c-80ae5da9fe7b-Numbered_802ba14e-f126-41f9-b205-961f60c532e7-Numbered_94c61763-4180-4a62-a0cc-d0e7cdd3b67f-Numbered_fea6dd7d-6719-4b 1细胞标准 1. 1 细胞形态 用含 8%犊牛血清的 DMEM 细胞培养液，37 C、5%C0 培养 2h 即可贴壁，24h,内可长成单层。

16、显微镜下，细胞呈三角形、多角形、圆形等多种 形态。 1. 2 外源病毒检验 培养 7 个细胞单层，每个单层至少 6cm天，每日观察细致细胞病变病毒检验 1.2. 1 取 2 胞，应无细胞病变。 1.2.2 血吸附病毒检验 按现行中国兽药典进行检验，应无红细胞吸附现 象。 3. 1. 2. 3 其它特定病毒的检验 采用 PCR或 RT-PCR 方法检测，应无 BVDV. PCV、 CSFV、PPV. PRV 和 JEV 污染。 3.1.3 胞核学检查 对不同传代水平的细胞， 取 50个处于有丝分裂中期的细胞 进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在。 与基础细胞库的

17、细胞相。核型必须相同。15%Lt,所有细胞的染色体模式数不得 咼出 :个待检细胞，同时用 lOHela 用无胸腺小鼠至少 10只，各皮下或肌肉注射 31.4 致瘤性检验&个细胞，作为阳性对照，用鸡胚成纤维细胞作为 10 细胞皮下或肌肉 注射无胸腺小鼠，每只阴性对照。观察 21日，Marc-145 细胞应无肿瘤形成，阳 性对照组应出现明显的肿瘤，阴性对照组应为阴性。 3.1.5 无菌检验 按现行中国兽药典进行检验，应无菌生长。 3.1.6 支原体检验 按现行中国兽药典进行检验，应无支原体生长。 3.2 细胞代次 基础细胞应为 110代，工作细胞代次应为 1025 代，生产用细 胞应在40

18、 代以内。 4. 3 保存 液氮保存。保存期 36 个月。 4 疫苗制造及半成品检验 5. 1 生产用毒种制备 4. 1. 1 毒种繁殖 将已长成单层的 Marc-145 细胞倒去生长液，换以含 2%毒种 的细胞维持液，置 37 C 下培养 23 天，当 70%以上细胞出现病变时收获， 置-40 C 冻融 1次，离心后分装，然后进行鉴定。 1. 2 毒种鉴定 按 1. 2. 1、1. 2. 2、1. 2. 5 项进行，应符合规定。符合上述标准 的毒种作为生产用毒种。 1. 3 毒种保存 在-70 C 下保存，应不超过 12个月。 1.4 毒种继代 应不超过 3代。 2 清场和记录 ?Numbe

19、red?Bulleted-Numbered_8286a19e-ff4f-436d-afa0-0701212d6f0a-Numbered_c35bacc3-45c6-49fe-ab3c-80ae5da9fe7b-Numbered_802ba14e-f126-41f9-b205-961f60c532e7-Numbered_94c61763-4180-4a62-a0cc-d0e7cdd3b67f-Numbered_fea6dd7d-6719-4b 2.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃 物等应按规定分别进行处理。 2. 2 全面填写生产记录。 5 半成品的制备 5.

20、1 条件准备 5.1.1 根据毒液繁殖所需物料及设备条件，进行全面准备。 5.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 5.1.3 在工作开始询 3040min,按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别 要求。 5.2 操作规则 521 接种 取所需数量的、细胞覆盖率达到 80%以上的细胞转瓶，弃去生长 液，按 2%小时)培养。/转旷 12 旋转(胎牛血清的细胞培养液，37 C2%)接 种病毒，加入含 V/V (. 2.2 收获 在显微镜下观察山病毒引起的细胞病变(CPE),直至 CPE达到 70%以上收获细胞培养物，反复冻融 1 次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于 -4

21、0 C 以下。 ?Numbered?Bulleted-Numbered_8286a19e-ff4f-436d-afa0-0701212d6f0a-Numbered_c35bacc3-45c6-49fe-ab3c-80ae5da9fe7b-Numbered_802ba14e-f126-41f9-b205-961f60c532e7-Numbered_94c61763-4180-4a62-a0cc-d0e7cdd3b67f-Numbered_fea6dd7d-6719-4b 3 半成品检验 .oTCID/mLlOo 5. 3.1 病毒含量取病毒液按 1.2.1项进行检验， 病毒含量应事 柘32 无菌

22、检验 按现行中国兽药典进行检验，应无菌生长。 4 清场和记录 5.4.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废 弃物等应按规定分别进行处理。 5.4.2 全面填写生产记录。 6 配苗 6.1 条件准备 6.1.1 根据配苗所需物料及设备条件，进行全面准备。 6.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 6.1.3 在工作开始前 3040min,按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别 要求。 6.1.4 将检验合格的半成品于配苗前取出，融化待用。 6.2 操作规则 2.1 配制 将经检验合格的病毒液按比例添加蔗糖脱脂乳冻干保护剂， 充分 混合均匀。

23、 63 清场和记录 ?Numbered?Bulleted-Numbered_8286a19e-ff4f-436d-afa0-0701212d6f0a-Numbered_c35bacc3-45c6-49fe-ab3c-80ae5da9fe7b-Numbered_802ba14e-f126-41f9-b205-961f60c532e7-Numbered_94c61763-4180-4a62-a0cc-d0e7cdd3b67f-Numbered_fea6dd7d-6719-4b 3. 1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废 弃物等应按规定分别进行处理。 63. 2 全面填

24、写生产记录。 7 疫苗的分装 操作内容见分装岗位标准操作规程。 8 疫苗的冻干 操作内容见冻干标准操作规程。 7 轧盖、贴标 操作内容见轧盖标准操作规程、贴标标准操作规程。 包装 8 操作内容见包装标准操作规程 III成品检验 见伪狂犬病活疫苗（B吐 tha-K61 株）制造及检验试行规程 IV、工艺卫生与人员卫生 1 定期对洁净室进行消毒，并根据沉降菌测定结果决定消毒周期。 2 操作间的卫生按各自区域的清洁消毒规程进行。 3 生产设备按各自清洁规程进行清洁消毒。 4 原辅料进入生产区按规定程序进行清洁消毒。 5 人员进入洁净区时，必须按规定进行人净。进入洁净区程序：更鞋一脱外衣 -穿普通工作服一更鞋一脱普通工作服一洗手一穿洁净服一手消毒一进入十万 级洁净区一更鞋手消毒套洁净服一手消毒进入万级洁净区。 6 人员在生产区内按区域个人卫生要求进行管理。 7 一般区工作服每三天清洗一次，十万级区工作服每天清洗一次，万级区工作 服每班清洗一次，万级洁净区使用的工作服在清洗后进行灭菌，活毒操作区的工 作服须经灭菌后才能进行清洗。 8 洁净室温度控制在 1826 C,相对湿度控制在 30-