(完整版)PCR技术的原理与方法

1、pcrpcr技术的原理与方法技术的原理与方法 钟召迪钟召迪pcr定义l 聚合酶链反应(polymerase chain reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。l 是指在dna 聚合酶的催化下，以母链dna 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母链模板dna互补的子链dna的过程。l 可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等。pcr反应特点l特异性强l灵敏度高l简便、快速l对标本的纯度要求低pcr技术的基本原理lpcr的反应成分lpcr的反应基本步骤lpcr的反应体系pcr的反应成分l模板dna l引物l

2、四种脱氧核糖核苷酸ldna聚合酶l反应缓冲液，mg2pcr的反应基本步骤lpcr的反应基本步骤l变性：高温使双链dna解离成单链（94 ，30s）l退火：低温下，引物与dna模板互补区结合（55 ， 30s ）l延伸：中温延伸，dna聚合酶催化以引物为起点的dna链延伸反应（7072 ，3060s）pcr的反应体系 10扩增缓冲液 1/10体积 4种dntp混合物 各200umol/l 引物 (2个) 0.2umol/l 模板dna 102 105 taq dna聚合酶 1 2.5单位/反应体系 mg2+ 1.52.5mmol/l 加双或三蒸水至 25 50ulpcr反应五要素l引物（prim

3、er）l 酶 （taq dna polymerase） l dntp （datp,dgtp,dctp,dttp） l模板 （template） lmg2+ （magnesium）引物l引物是pcr特异性反应的关键lpcr 产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度l理论上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 pcr就可将模板dna在体外大量扩增引物设计的原则l引物最好在模板cdna的保守区内设计l引物长度一般在1530碱基之间l引物gc含量在40%60%之间，tm值最好接近72l引物3端要避开密码子的第3位l引物3端不能选择a，最好选择tl碱基要随机分布l

4、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物设计的原则l引物5 端和中间g值应该相对较高，而3 端g值较低l引物的5端可以修饰，而3端不可修饰l扩增产物的单链不能形成二级结构l引物应具有特异性酶及其浓度l目前有两种 taq dna 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成l一个典型的 pcr反应约需酶量 2.5u（指总反应体积为100 ul时）l浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dntp 的质量与浓度dntp的质量与浓度和 pcr扩增效率有密切关系dntp呈颗粒状， 保存不当易变性失活dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1m naoh或1m tris

5、-hcl的缓冲液将其ph调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dntp降解在pcr反应中，dntp应为50200umol/l，尤其是注意4种dntp的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低pcr产物的产量dntp 能与mg2+结合，使游离的mg2+浓度降低模板（靶基因，target gene）l模板核酸的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一l传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k 来消化处理标本sds 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋

6、白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶k 能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸mg2+浓度lmg2+对pcr扩增的特异性和产量有显著的影响l在一般的 pcr反应中，各种ntp浓度为200umol/l时，mg2+浓度为1.52.0 mmol/l为宜lmg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少pcr反应条件的选择 pcr反应条件: : 温度 时间 循环次数温度与时间的设置l设置变性-退火-延伸三个温度点l标准反应中采用三温度点法，双链dna在909

7、5变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸l对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸变性温度与时间l变性温度低，解链不完全是导致pcr失败的最主要原因l一般9394lmin足以使模板dna变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。l此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变性，就会导致pcr失败退火(复性)温度与时间l退火温度是影响pcr特异性的较重要因素l变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板dna 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞l退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度l对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想延伸温度与时间l延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。l延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1kb以内的dna片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10kb需延伸至15minl延伸进间过长会导致非特异性