系统化的LC方法开发策略小结

1、一、系统性筛选策略先按流动相ph、有机相和固定相的直接组合进行系 统性筛选测试评估结果，选择最有效的条件组合再进行方法优化梯度/温度、影响选择性的主要因素1、固定相2、有机溶剂3、流动相phimpact on% improvem(resolutioridouble n20 - 40%double k15 - 20%double a> 400%|色谱柱小结：典型的c8和c18柱间分离选择性差异不大在多数情况下，c8提供比c18弱的色谱保留，因此c8 柱对非常疏水性的化合物来讲是个良好的选择通常，使用c8柱还是c18柱视个人偏好-极性嵌入型固定相（rp8/rp18柱）会赋予与c8/c18 显

2、著不同的分离选择性，对含酚羟基的多酚类化合物尤甚_苯基柱亦会赋予与c8/c18显著不同的分离选择性， 对多环类芳香化合物尤为如此-构建在不同基体材料上色谱柱（例如硅胶柱和杂化 颗粒柱）会呈现不同的分离选择性方法开发需用考虑基体材料不同所带来的差别流动相溶剂小结：甲醇氢键作用中的质子供给者较低的洗脱强度一相对较高的柱压乙月青氢键作用中的质子接受者中等洗脱强度一粘度最低（柱反压最低）-作为最常使用的反相色谱洗脱溶剂，甲醇和乙睛经 常呈现显著的分离选择性差异若将两者混合可对分离选择性进行微调-同时改变色谱柱和流动相溶剂通常可扩大分离选择 性差异流动相ph小结：硅胶颗粒色谱柱ph范围：28杂化颗粒色谱

3、柱ph范围：112对于含有有机酸和碱混合物的分离，流动相ph是最强 大的分离选择性工具_当分析物间含有相近的pka值时（例如全为有机酸 或碱时），流动相溶剂和色谱固定相成为影响分离选 择性的重要因素_流动相ph的选择对方法稳定性、耐用性具有重大影 响，因此是方法开发中需要当作重中之重的因素进行 关注的方面切记，要取得最好的色谱保留与峰形：有机酸需要在低ph下分析有机碱需要在高ph下分析同时，要在分析物pka+/-2范围之外进行方法开发， 以提高方法的重现性和耐用性使用ph12的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的注意事 项：_中等ph尤其是高ph磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。 ph12的磷酸盐缓冲液

4、只有在绝对需要时，例如在进行 低uv波长检测或者有机碱分析物的pka大于10时，方才建议使用。_在通常的uv检测波长范围内（例254nm）,有许多对 填料颗粒腐蚀性很小的高ph缓冲系统可供使用，包括 碳酸氢鞍、三乙胺、氨水等都可方便地提供ph在9-11 之间的良好缓冲能力-在绝对需要使用到ph12的磷酸盐缓冲液的场合，需 要注意如下事项：柱温务必保持在30oc以下保持柱上缓冲液浓度在5 to 10 mm之间注意当流动相中含有高组份的有机溶剂时，磷酸盐 可能会在柱上和仪器管线内析出。可预先在烧杯内做 流动相混合试验观察有无沉淀生成。一缓冲液一定要预先过滤使用保护柱可增加分析柱的寿命进行lc方法开

5、发前需要了解的信息:-样品的溶解度样品中待分析物的数目您需要分开多少个峰？_官能团；待分析物有怎样的差别?是否有可离子化的官能团？流动相ph值对色谱行为 会有怎样的影响？-检测条件需要什么样的检测技术？什么检测器类型？-待分析物在样品中的浓度范围，定量要求-是否有基质干扰？方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快 的分离，以达致最高的样品通量和最省的流动相耗量。评估选择时的考虑与步骤：浏览所得谱图，选择最佳组合。考虑：分离所有的色谱峰还是主要分析成分而已？对分离度的要求？对峰拖尾因子的要求？对色谱保留的要求？对峰流出方式的要求？（如希 望杂质峰在前、主峰在后）一梯度分离还是等度分离方法？_步骤1:选择流动相ph-步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂步骤3:对选定的最佳条件组合下的分离进行优化或微调一旦我们固定了 ph,流动相组成和色谱柱，我们就 可以对方法进行微调及优化_ lc方法优化的参数流速尤其是大分子物质梯度较缓的梯度通常会提高分离度，但会降低灵敏度 较陡的梯度通常会降低分离度