蛋白酶活性测定方法

1、.水产动物酶活性测定方法一 、分析样品的采取与处理每箱随机各取3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用 4冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入 26冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。二、 酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡 0.5g，放入离心塑料管中， 加 4ml，4冷却去离子水稀释， 4下离心 20min（ 13，000g ），上清液标号分装，并与 4冰箱中冷却保存， 24Hr 待测。将肝胰脏及肠道组织用4去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。按样品重量加10 倍

2、的 4冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴） 。匀浆液在4下离心20 分钟（ 13，000g），上清液标号分装， 并于 4冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。酶粉及饲料：取 20 克酶粉，先用10 倍 PH7.0 缓冲液溶解，并放在40水浴中恒温30 分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10 倍， 20 倍， 100 倍即可。取 2.0 克饲料， 加 PH7.0 缓冲液 20ml 溶解 , 并放在 40水浴中恒温30 分钟，过滤留置滤液待测。三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。方法：福林酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分

3、解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。1.2 蛋白酶活性单位：1 克食靡或组织在 30，PH 在 7.0 的条件下， 每分钟水解酪蛋白产生 1 微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（ Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至 1， 000ml ，存放与具胶塞的试剂瓶中。3.0.1M 三氯醋酸（ TCA ）：用小烧杯称取65.4g 三氯醋酸，加水溶解后定容为1， 000ml 。4.L 酪氨酸。5.缓冲液：磷酸二氢钙氢氧化钠

4、缓冲液。A ：0.2mol/LKH2PO4 (ml):50;B ：0.2mol/LNaOH(ml)29.63C：水（ ml ）120.37PH（ 20）：7.06酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N 氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液， 在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml 容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入12 滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4保存一周，变质后不能使1 / 4.用。1.4 标准酪氨酸曲线的绘制1. 将精确称取 L 酪氨酸 （先在 105干燥 23Hr ）100mg 小心地溶于 60ml0.1mol/LHC

5、L中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别，一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L ，该溶液含酪氨酸 100 微克 /毫升。2. 根据下面的规定，从上述储备溶液制备含酪氨酸 10、 20、 30、 40、 50、70、 80 微克 /毫升。3.移取上述溶液2ml ，加入一系列试管中， 加 5ml 0.4M Na 2CO3 然后加稀释的福林试剂1ml 至各试管，立即混合均匀，并在30恒温水浴中显色20min ，以 721 型（或 72 型）分光光度计在波长680nm 处测定光密度 （O。D 值）。4.计算 K 值；以 OD 值为纵坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线，微克数，

6、确定K 值。1.5 操作步骤将酪蛋白溶液放入30恒温水浴中预热5min，取 1ml 酶液注入试管中，按以下程序操作。酶液 1ml 在30恒温水浴中预热12min+2%酪蛋白 1ml 加入时立即记时，精确反应10min+0.4MTCA2ml 立即摇匀，终止反应。将各管剧烈混合并在30保持 30min ，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。从水浴中取出静止10min 过滤（ 11cm 的 whatman43# 滤纸）+滤液 1ml+0.4MNa2CO35ml+稀释福林试剂1ml摇匀， 30恒温水浴显色20 分钟测定 OD 值用720 型分光光度计测定（波长680nm）空白试验：酶液1ml ，先向其中加入

7、三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。1.6 计算公式（公式 1）活力单位 =4/10 × K × OD × n/m其中： 4反应总体积为4ml10反应的时间为10minK 比色计常数n酶液稀释倍数m- 样品的质量（g）（公式 2）2 / 4.活力单位 =× 4×n/10/m其中：酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。4反应的总体积10反应10 分钟n 酶稀释倍数m-样品的质量（g）2碘淀粉比色法测定淀粉酶21 原理淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝

8、色复合物， 根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量， 从而计算 AMS 的活力。22 试剂1 0.4mg/ml底物缓冲液：60ml× 2 瓶， 4冰箱保存。20.1mol/L碘储备液： 7ml × 2 瓶， 4避光保存。0.01mol/L碘应用液的配制：将储备液：蒸馏水=1： 9 稀释， 4避光保存。23 操作测定管（ u 管）空白管（ o）管底物缓冲液 (ml)30 预温 5 分钟1.01.0酶液（ ml）0.02混匀， 30水浴，准确反应 7.5 分钟碘应用液 (ml)1.01.0蒸馏水6.06.02混匀在 660nm 波长， 1cm 光径，蒸馏水调零测光密度。2 4 活性

9、单位：1 克食靡或组织中AMS ，在 30与底物作用 1min ，水解 1mg 淀粉为1 个单位。2 5 计算公式（空白管吸光度测定管吸光度）×0.4× 1min × 4× FAMSu/dl=空白管吸光度× 1.0× 7.5min × 0.02× M注：0.4-底物缓冲液浓度1.0-活性单位定义水解1mg 淀粉量4-酶液稀释了 4 倍0.02 -酶液F-测定时稀释的倍数W-样品重量（ g）3 脂肪酶活性测定加 5mL 0.025 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液和 4mL 聚乙烯醇橄榄油乳化液于 100 mL 锥形瓶中，置反应温度（ 37）水浴中预热 510min，然后加入匀浆粗酶液1mL，准确反应 30min 后，立即加入 95%乙醇 15mL