叶绿体色素的提取理化性质与含量测定ppt课件

1、 提取叶绿体色素提取叶绿体色素 分析叶绿素的物理、化学性质分析叶绿素的物理、化学性质 测定叶绿素的含量测定叶绿素的含量 提取和测定植物组织中的光合色素是研讨光提取和测定植物组织中的光合色素是研讨光协作用机理的重要技术手段。协作用机理的重要技术手段。1. 实验目的及意义实验目的及意义 2.1 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素用含水的有机溶剂提取叶绿素2. 实验原理实验原理 亲水的亲水的“头部：镁原子居于卟啉环的中头部：镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子那么央，带正电性，与其相联的氮原子那么偏向于带负电性，因此卟啉具有极性，偏向于带负电性，因此卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质

2、结合。是亲水的，可以与蛋白质结合。亲脂的亲脂的“尾巴：叶绿醇是由四个异戊二尾巴：叶绿醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决议了叶绿素的脂溶性。链，它决议了叶绿素的脂溶性。 纯的有机溶剂不能突破叶绿体色素与蛋白质的联络，纯的有机溶剂不能突破叶绿体色素与蛋白质的联络，所以必需用能与水混溶的有机溶剂并有少量水存在时，才所以必需用能与水混溶的有机溶剂并有少量水存在时，才干将叶绿体色素提取出来。干将叶绿体色素提取出来。80%80%丙酮丙酮95%95%乙醇乙醇丙酮丙酮: :乙醇乙醇: :水水(4.5:4.5:1)(4.5:4.5:1)2.2 2.2 叶

3、绿素的物理性质叶绿素的物理性质1 1叶绿素的吸收光谱叶绿素的吸收光谱红光区：红光区：640660 nm篮紫光区：篮紫光区：430450 nm胡萝卜素和叶黄素：胡萝卜素和叶黄素：400500 nm不用蓝光区测不用蓝光区测叶绿素含量。叶绿素含量。2 2荧光景象荧光景象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色的景象。色的景象。2.3 2.3 叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质叶绿素是叶绿酸的酯叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯叶绿素是叶绿酸的酯叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素可以与碱起皂化反响

4、而生成醇甲醇和叶绿醇和叶绿酸叶绿素可以与碱起皂化反响而生成醇甲醇和叶绿醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。开。1 1皂化反响皂化反响叶绿酸的盐构成以后，因分子极性增大，易溶叶绿酸的盐构成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；一部分苯分散在水中构成乳胶体，出现一层乳一部分苯分散在水中构成乳胶体，出现一层乳白色的溶液。白色的溶液。 低温下发生皂化反响的叶绿体色素溶液，易乳化而出低

5、温下发生皂化反响的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。2 2取代反响取代反响卟啉环中的卟啉环中的Mg处于不稳定的形状，可被处于不稳定的形状，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。等离子取代。稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg可以被可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿所取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇素，去镁叶绿素遇Cu2+那么成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳那么成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏常用醋酸铜处置来保管绿色植物标本。定，在光下不易破坏常用醋酸铜处置来保管绿色植物标

6、本。浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并构成去镁叶绿酸，呈褐绿色。分解出叶绿醇，并构成去镁叶绿酸，呈褐绿色。1 1吸收光谱吸收光谱 红光区：红光区：640660 nm640660 nm；篮紫光区：；篮紫光区：430450 nm 430450 nm 。2 2荧光景象荧光景象 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。3 3皂化反响皂化反响 叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反响而生成醇和叶叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反响而生成醇和叶绿酸的

7、盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。分开。 4 4取代反响取代反响 在稀酸中，叶绿素中的镁可以被在稀酸中，叶绿素中的镁可以被H+H+所取代而成褐色的去所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇镁叶绿素，后者遇Cu2+Cu2+那么成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很那么成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的稳定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的MgMg被被H+H+取代，且生取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并构成去镁叶绿酸，呈褐绿色。成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并构成去镁叶

8、绿酸，呈褐绿色。 5 5叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分别以后，破坏更快，而类胡萝卜素那么较稳定。素与蛋白质分别以后，破坏更快，而类胡萝卜素那么较稳定。叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质 1叶绿素叶绿素a、b分别在分别在665nm和和649nm波优点波优点95%乙醇提取有最大的吸乙醇提取有最大的吸收峰，同时在该波优点叶绿素收峰，同时在该波优点叶绿素a，b的比吸收系数的比吸收系数K为知，我们即可以根据为知，我们即可以根据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：定律，列出以下关系式： Ca=13.95A

9、665 6.88 A649 Cb=24.96 A649 7.32 A665 CT =Ca + Cb= 18.08 A649 + 6.63A665A665和和A649为叶绿素溶液在波长为叶绿素溶液在波长665 nm和和649 nm时的吸光度时的吸光度Ca、Cb、CT分别为叶绿素分别为叶绿素a 、 b及总的浓度，以及总的浓度，以mgL-1为单位为单位 2叶绿素叶绿素a 、b在在652 nm波优点有一样的比吸收系数均为波优点有一样的比吸收系数均为34.5，在此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素a 、b的总浓度。的总浓度。 CT=A652

10、100034.5 3叶绿素的含量叶绿素的含量mg/g= 叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取液体积提取液体积稀释倍数稀释倍数/样品样品鲜重鲜重 2.4 2.4 叶绿素含量的计算叶绿素含量的计算 3. 资料、仪器设备与试剂资料、仪器设备与试剂资料：菠菜叶片资料：菠菜叶片仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试剂：石英砂、碳酸镁、试剂：石英砂、碳酸镁、95乙醇、乙醇、20%NaOH-甲醇、甲醇、 苯、苯、 36%乙酸、醋酸铜、浓盐酸乙酸、醋酸铜、浓盐酸 叶绿体色素提取叶绿体色素提取 称取新颖去大叶脉的菠菜叶片称取新颖去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎

11、放入研钵中，剪碎放入研钵中， 加少加少量石英砂和碳酸镁及量石英砂和碳酸镁及5ml 95乙醇，研成均浆，过滤入乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用容量瓶，分别用5ml 95乙醇冲洗研钵乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，次，冲洗液同样过滤，搜集滤液，倒入容量瓶中，最后用搜集滤液，倒入容量瓶中，最后用95乙醇定容至乙醇定容至25ml，放，放入暗处备用。入暗处备用。 2. 叶绿素的荧光景象叶绿素的荧光景象 取叶绿素提取液取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下察看溶液的放入试管中，在直射光下察看溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？透射光及反射光的颜色有何不同？ 结果与分析结果与分析1 3.

12、 光对叶绿体色素的破坏作用光对叶绿体色素的破坏作用 取两支试管，各参与叶绿体色素提取液取两支试管，各参与叶绿体色素提取液2ml，一管放在直，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，射光下，另一管放在黑暗处，12 h后察看两管溶液颜色有后察看两管溶液颜色有何变化？结果与分析何变化？结果与分析24. 实验步骤实验步骤4. 叶绿素的皂化作用叶绿素的皂化作用 3ml提取液提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇摇匀甲醇摇匀 冷却冷却 + 3ml苯摇匀苯摇匀 + 3ml蒸馏水逐滴加，摇匀蒸馏水逐滴加，摇匀 静置，察看分层景象。静置，察看分层景象。下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素下层是稀的乙醇溶液，其中

13、溶有皂化的叶绿素a和和b以及少量以及少量的叶黄素；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄的叶黄素；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。素。 对照：另取对照：另取3ml 叶绿体色素提取液，参与叶绿体色素提取液，参与2ml 苯和苯和2ml 蒸馏水蒸馏水察看与皂化的叶绿素有何不同？察看与皂化的叶绿素有何不同？结果与分析结果与分析360水浴水浴 3min5. H+和和Cu2+对叶绿素分子中对叶绿素分子中Mg2+的取代作用的取代作用1汲取叶绿体色素提取液汲取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴参与放入试管中，逐滴参与36%乙乙酸数滴，摇匀，察看溶液颜色的变化。酸数滴，摇匀，察看溶液颜色的

14、变化。 结果与分析结果与分析4.12当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，水浴加热，察看溶液颜色变化，与未加醋酸铜同酸铜粉，水浴加热，察看溶液颜色变化，与未加醋酸铜同时加热的一管相比较。结果与分析时加热的一管相比较。结果与分析4.23汲取叶绿体色素提取液汲取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴参与浓盐酸，放入试管中，逐滴参与浓盐酸，察看颜色变化。察看颜色变化。 结果与分析结果与分析4.36. 叶绿体色素含量测定叶绿体色素含量测定汲取叶绿体色素提取液汲取叶绿体色素提取液5ml，用，用95%乙醇定容至乙醇定容至50ml。以。以95

15、%乙醇为空白对照，在波长乙醇为空白对照，在波长665nm、649nm、652nm下测定吸光下测定吸光度，并分别计算叶绿素度，并分别计算叶绿素a和叶绿素和叶绿素b的浓度的浓度Ca、Cb：mg/L，二者之和为总叶绿素的浓度。，二者之和为总叶绿素的浓度。最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量叶绿素的含量mg/g= 叶绿素的浓度叶绿素的浓度稀释倍数稀释倍数提取液体提取液体积积 /样品鲜重样品鲜重比较两种方法所得的实验结果。比较两种方法所得的实验结果。 结果与分析结果与分析55. 结果与分析结果与分析详见实验步骤结果与分析详见实验

16、步骤结果与分析1-66. 本卷须知本卷须知1为了防止叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进展，为了防止叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进展，研磨时间应尽量短些，以不超越研磨时间应尽量短些，以不超越2分钟为宜。分钟为宜。2叶绿体色素提取液不能浑浊，否那么应重新过滤。叶绿体色素提取液不能浑浊，否那么应重新过滤。3分光光度计的正确运用。分光光度计的正确运用。1用不含水的有机溶剂提取植物资料特别是干资料的叶绿用不含水的有机溶剂提取植物资料特别是干资料的叶绿体色素往往效果不佳，缘由何在？体色素往往效果不佳，缘由何在？2研磨提取叶绿素时参与研磨提取叶绿素时参与MgCO3，有什么作用？，有什么作用？3叶绿素叶绿素a、叶绿素、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波出息展叶绿素收峰波出息展叶绿素a、叶绿素、叶绿素b的定量分析？为什么？的定量分析？为什么？ 7. 思索题思索题参与少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素遭到破坏。参与少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素遭到破坏。详细的情况是这样的